橄榄核果采后场景下经深绿木霉（Trichoderma atroviride）培养滤液或橄榄假丝酵母（Candida oleophila）细胞预处理后在橄榄核果（Olea europaea）感染橄榄疫霉（Phytophthora oleae）期间的比较转录组学响应

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Comparative transcriptomic responses of olive drupes pre-treated with Trichoderma atroviride culture filtrate or Candida oleophila cells during Phytophthora oleae infection in a postharvest scenario

　　

由橄榄疫霉（Phytophthora oleae）引起的橄榄核果软腐病是首次在意大利报道的新兴病害。研究人员采用RNA-seq分析探究橄榄核果对P. oleae的转录响应。同时评估两种生物预处理：拮抗丝状真菌深绿木霉（Trichoderma atroviride）的培养滤液与拮抗酵母橄榄假丝酵母（Candida oleophila）的细胞悬液，均在接种病原前24 h施用。虽未实现完全保护，两种预处理均显著降低接种核果的腐烂严重度，其中T. atroviride培养滤液降低56%，C. oleophila细胞降低52%。在接种后72 h（hpi）观察到病斑大小明显差异，故选该时点进行RNA-seq。相比伤口对照核果，单独接种P. oleae、T. atroviride滤液预处理后接种、C. oleophila预处理后接种分别鉴定出2307、1714、1816个差异表达基因（DEGs）。选取RNA-seq响应基因在24、72、168 hpi经RT-qPCR验证。RNA-seq与RT-qPCR联合结果表明，两种生物预处理均显著调控橄榄核果防御与胁迫相关转录响应，同时在P. oleae感染期间呈现出部分不同的调控特征。

研究背景与立项依据

橄榄疫霉（Phytophthora oleae，隶属 Phytophthora Clade 2 的 2d 亚支）是意大利南部新发病原，侵染成熟橄榄核果引发软腐，症状常与由 Colletotrichum spp. 引起的橄榄炭疽病重叠。现有防治策略多聚焦炭疽病并依赖合成杀菌剂，对卵菌所致新兴果实腐病关注不足。橄榄核果表面微生物组中，深绿木霉（Trichoderma atroviride）培养滤液含抗真菌肽类（peptaibols）、激发子蛋白及次生代谢物，橄榄假丝酵母（Candida oleophila）菌株 O 作为活体生防菌（BCA）已有商业化先例。然而在 P. oleae–橄榄核果–BCA 三元系统中，宿主转录重编程特征尚未被刻画，限制了生防剂筛选与采后集成管理优化。该研究以离体核果模拟采后机械伤场景，系统比较代谢物型（T. atroviride 滤液）与活体型（C. oleophila 细胞）两类 BCA 预处理对 P. oleae 软腐的缓解效应及宿主转录重塑，论文发表于《Physiological and Molecular Plant Pathology》。

主要技术方法概括

研究人员自意大利卡拉布里亚 Mirto-Crosia 果园采集 15 年生 Coratina 橄榄树成熟核果（成熟指数 MI4），表面灭菌后于赤道区制造标准化伤口（深≤2 mm）。设立七组处理：ID0 完整蒸馏水对照、ID1 伤口蒸馏水、ID2 伤口+蒸馏水+接种 P. oleae、ID3 伤口+T. atroviride 滤液、ID4 伤口+C. oleophila 细胞、ID5 伤口+滤液预处理24 h后接种、ID6 伤口+酵母细胞预处理24 h后接种。腐烂严重度在 24、72、168 hpi 按 0–4 级经验量表评估并计算相对病害进展曲线下面积（rAUDPC）。转录组在 72 hpi 取伤口周边组织用 Illumina HiSeq 4000 双端 150 bp 测序（约 30 M reads/样），以 Olea europaea var. sylvestris 参考基因组（GCF_002742605.1）经 HISAT2 比对、StringTie 定量、DESeq2 鉴定 DEG（FDR≤0.05, |log₂FC|≥1），GO 富集用 clusterProfiler；24/72/168 hpi 选免疫、病程相关、受体信号及膜应激基因以 tubulin α-3 为内参行 RT-qPCR（2^?ΔΔCt法）验证。

研究结果

3.1 生防预处理对 P. oleae 软腐的严重度影响

离体核果接种 P. oleae 后，ID2 对照 rAUDPC 为 0.43，ID5（T. atroviride 滤液预处理）降至 0.19（降 56%），ID6（C. oleophila 细胞预处理）降至 0.21（降 52%），72 hpi 病斑显著缩小，证实两类预处理均具中效保护但未完全免疫。

3.2 RNA-seq 分析

3.2.1 机械伤口响应：ID1 vs ID0 得 233 DEG（192 上调/41 下调），上调含 berberine bridge enzyme-like、ACC 合酶样、乙烯响应转录因子、dirigent 蛋白、β-amyrin 28-氧化酶样，确认伤口构成基础转录背景。

3.2.2 病原与单剂响应：ID2 vs ID1 独有 2298 DEG，ID3（滤液单用）vs ID1 独有 125 DEG，ID4（酵母单用）vs ID1 独有 109 DEG；ID5 vs ID2 独有 964 DEG，ID6 vs ID2 独有 1066 DEG，ID5 与 ID6 共享 750 DEG（Pearson r=0.977，99.2% 同向）。共享 DEG 的 GO 注释显示 DNA 模板转录调控、蛋白磷酸化、泛素化双向调节，而翻译与防御响应（含 BON1-associated protein 1/2-like、STH-2-like）协同下调，钙结合与细胞色素 P450 相关氧化还原项以下调为主。

3.3 GO 富集分析

3.3.1 ID2/ID3/ID4 vs ID1：ID2 富集免疫调控、防御响应、ROS/H₂O₂响应、自噬、冷热盐镉胁迫，上调 SARD1-like、WRKY53/70、CML30、MAPK3、G 型凝集素受体样激酶，下调 ILR1-like5、EDR2-like、EIN2-like、LysM-RLK3；ID3 滤液单用富集 SAR、免疫调控，上调 EG45 域蛋白、PR 叶蛋白 6、葡聚糖内切-1,3-β-葡萄糖苷酶，下调 NPR1、thaumatin-like、胰蛋白酶抑制剂；ID4 酵母单用富集 ROS 响应、几丁质代谢、水通道蛋白 PIP1-2/PIP1-4 上调，basic endochitinase、kunitz 胰酶抑制剂上调。

3.3.2 ID5/ID6 vs ID2：ID5 滤液预处理后接种重塑防御响应、JA 介导信号、单糖代谢，上调 NPR2-like、GT-2-like、CBL 互作激酶 1-like，下调 BON1/BAP1-like、CML30、SARD1、WRKY70、MAPK3；ID6 酵母预处理后接种同样下调 BON1/BAP1、CML30、SARD1、WRKY70、MAPK3，但上调 NTF3/NTF3-like、CBL 互作激酶 23-like、ERF2-like、NPR2-like，并富集伤口愈合、几丁质响应、光强与低氧响应。

3.4 RT-qPCR 验证

选 BON1-associated protein 2-like、STH-2-like、FERONIA-like、Tetraspanin-8-like 在 24/72/168 hpi 验证。ID2 中 BON1 持续强上调，STH2 后期下调，FERONIA 弱变，Tetraspanin-8 72 hpi 峰值；ID3/ID4 单用 STH2 早后期高表达。ID5/ID6 预处理后接种均使 BON1 全程抑制（ID6 更强），STH2 在 ID6 早期更高、ID5 后期回升，Tetraspanin-8 双处理早期抑制、ID6 更甚，趋势与 RNA-seq 一致。

讨论与结论浓缩

研究人员指出，离体核果模型捕获的是伤口局部宿主响应而非全株系统响应。P. oleae 单染广泛激活 SA（SARD1-like、WRKY53/70）与 JA/ET（ERF104、OPR3 样）交叉防御，同时诱导负调因子 BON1/BAP1-like 及自噬相关 WRKY33 与多重 ATG 转录本下调，提示卵菌效应子可能重定向宿主自噬与 UPS（泛素–蛋白酶体系统）。T. atroviride 滤液单用即富集 SAR 与免疫调控，符合 peptaibols/cerato-platanin 类激发子假设；C. oleophila 单用偏向 ROS 清除、几丁质酶与营养竞争相关转录本。预处理后接种（ID5/ID6）共有 750 DEG 高度同向，均压制 P. oleae 单染时的 BON1/CML30/SARD1/WRKY70/MAPK3 模块，但 ID5 更偏 JA 单糖代谢重编程，ID6 额外调动伤口愈合、几丁质感知与低氧水通道响应，反映代谢物激发与活体酵母免疫 priming 的部分分轨。RT-qPCR 对 BON1、STH2、FERONIA、Tetraspanin-8 的动态校验支持 RNA-seq 结论。

结论翻译：两种 BCA 预处理均显著削减 P. oleae 软腐严重度（滤液 56%、酵母 52%），并在 72 hpi 伴随橄榄核果防御与胁迫转录网络的显著重编程；深绿木霉滤液与橄榄假丝酵母细胞虽共享大量同向 DEG（尤其下调 BON1/BAP1、CML30、SARD1、WRKY70、MAPK3 防御衰减模块），但在 JA 信号、单糖代谢、伤口愈合及几丁质/低氧响应项上保留部分特异签名，证实代谢物型与活体型 BCA 可通过部分重叠又非完全相同的宿主免疫 priming 机制贡献于采后橄榄果实病害管理。该研究首次给出 P. oleae–橄榄核果三元系统的转录组画像，为生防剂选型与滤液/活菌复配提供了分子依据。