OsPHO2通过泛素依赖的降解途径促进OsHMGB1降解以精细调控水稻磷酸盐稳态

《Plant Physiology and Biochemistry》：OsPHO2 Promotes the Ubiquitin-Dependent Degradation of OsHMGB1 to Fine-Tune Phosphate Homeostasis in Rice

　　

磷酸盐（Pi）稳态对水稻生长发育至关重要。既往研究表明，染色质结合蛋白OsHMGB1通过调节磷酸盐饥饿响应（PSR）基因的染色质可及性正向调控Pi积累；其在Pi缺乏条件下诱导表达，而在Pi充足条件下蛋白水平迅速下降，提示存在翻译后调控，但其蛋白降解机制尚不清楚。研究人员证实，Pi充足条件下OsHMGB1的降解依赖于泛素-26S蛋白酶体途径。OsHMGB1与水稻Pi信号负调控关键因子、E2泛素结合酶OsPHO2相互作用；pho2突变体中因蛋白降解减弱，OsHMGB1丰度升高；体内泛素化实验表明OsPHO2促进OsHMGB1泛素化。遗传分析显示，hmgb1pho2双突变部分抑制pho2老叶Pi过度积累表型，表明二者在Pi稳态中存在遗传互作。转录组分析揭示OsPHO2与OsHMGB1反向调控一系列PSR基因，经RT-qPCR验证包括OsPT1、OsPT4和OsRNS3。综上，OsPHO2部分通过介导OsHMGB1的泛素依赖降解维持水稻Pi稳态。

研究背景与立项依据

磷酸盐（Pi）是植物生长发育必需的大量元素，但土壤中Pi易被金属阳离子固定而低效利用，植物因而进化出复杂的Pi稳态调控网络。在拟南芥中，PHOSPHATE2（PHO2）作为E2泛素结合酶负调控Pi信号，其突变体表现为Pi过度积累；水稻同源蛋白OsPHO2（亦称LTN1）同样负调控Pi稳态，但此前已知其靶向OsPHF1、OsPHO1、OsPP95等，单独敲除这些靶点均不能完全回补pho2表型，提示仍存在未知底物。另一方面，染色质相关非组蛋白HMGB1在动物中由泛素化调控稳定性，而植物OsHMGB1虽被报道可结合PSR基因启动子、调节染色质可及性以维持Pi稳态，并参与抗病与抗旱，其蛋白稳定性如何受控完全未知。鉴于OsHMGB1在Pi充足时蛋白快速下降，研究人员推测其受泛素-蛋白酶体降解，并探索OsPHO2是否为其E2酶伴侣，从而揭示一条精细调控Pi稳态的新支路。该研究发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。

主要技术方法概览

研究人员以日本晴为背景构建hmgb1单突、pho2（Tos17插入系NE8536）单突及hmgb1pho2双突，并沿用HMGB1pro:HMGB1-GFP等既有转基因系；通过酵母双杂交（Y2H）与双分子荧光互补（BiFC）检测蛋白互作，以催化位点突变体OsPHO2^C719A作对照；采用无细胞降解实验比较野生型与pho2提取液中重组His-OsHMGB1半衰期；利用GFP磁珠免疫沉淀联合抗泛素抗体开展体内泛素化检测；结合Pi剥夺与组织分区Pi浓度测定、RT-qPCR及已发表的pho2与hmgb1转录组数据集进行交集与GO富集分析，从而从互作、降解、生理到转录层面闭环验证。

研究结果

3.1 OsHMGB1受泛素-蛋白酶体介导降解

研究人员用蛋白酶体抑制剂MG132处理幼苗，发现Pi充足与缺乏下OsHMGB1均累积且条件间差异消失，证实其周转至少部分依赖泛素-26S蛋白酶体途径。

3.2 OsHMGB1与OsPHO2相互作用

Y2H显示OsHMGB1截短体仅与失活型OsPHO2^C719A-BD互作而不与野生型互作；BiFC中仅OsHMGB1与OsPHO2^C719A组合在烟草细胞核内重现YFP信号，表明催化半胱氨酸参与动态结合，二者在核内形成瞬时复合体。

3.3 OsHMGB1在pho2突变体中累积

免疫印迹显示pho2根叶中OsHMGB1蛋白升高，而叶片转录本反降，证明为蛋白稳定性而非转录上调；Pi缺乏在野生型诱导OsHMGB1蛋白，但在pho2中该诱导消失；酵母中共表达OsPHO2^C719A时截短OsHMGB1蛋白量高于共表达野生型OsPHO2，进一步支持OsPHO2促其降解。

3.4 OsPHO2调控OsHMGB1泛素化与稳定性

无细胞降解实验中重组His-OsHMGB1在pho2提取液中降解慢于野生型，MBP对照稳定；体内IP-泛素印迹显示HMGB1-GFP/pho2中泛素化条带较HMGB1-GFP/WT显著减弱，证实OsPHO2促进OsHMGB1体内泛素化。

3.5 OsHMGB1突变部分抑制pho2老叶Pi过量表型

hmgb1pho2双突整体生长仍似pho2，低磷下生物量略恢复；总磷与Pi吸收速率在双突与pho2间无差，说明OsHMGB1不主要影响外源Pi获取；但高磷与低磷下双突老叶（尤其第一叶）Pi浓度较pho2显著下降约33%，呈随叶龄增强趋势，证明二者在叶内Pi重分配层面遗传互作，OsHMGB1主要作用于老叶Pi滞留。

3.6 OsHMGB1与OsPHO2共调PSR基因

交集pho2（高磷）与hmgb1（低磷）转录组，叶中643、根中178共有差异基因，其中逾67%呈反向表达；207个叶、55个根共有PSR基因富集于转运与磷代谢。RT-qPCR验证OsPT1、OsPT4、OsRNS3在pho2中强诱导，在hmgb1中下调，在hmgb1pho2中回退至近hmgb1水平，表明OsHMGB1部分介导OsPHO2对PSR基因的转录效应。

讨论部分总结

研究人员指出，OsHMGB1呈现转录与蛋白双级调控：缺Pi时转录诱导且降解放缓，足Pi时OsPHO2经泛素化清除之，该双重机制与动物HMGB1保守。OsPHO2此前已知靶向OsPHF1/OsPHO1/OsPP95，本文新增OsHMGB1为核定位底物，解释BiFC核信号及ER-核膜连续性可能允许OsPHO2核周池作用；pho2中OsHMGB1转录降而蛋白升，提示蛋白稳定性为主控、Pi过量引发负反馈。遗传上hmgb1pho2仅解老叶Pi囤积而非总吸收，说明OsPHO2–OsHMGB1模块偏重胞内Pi再动员与回收，有别于OsPHF1/OsPP95侧重吸收转运，构成组织分层调控。OsHMGB1结合OsPT4/OsRNS3启动子提可及性，pho2中该激活因OsHMGB1累积而放大，双突回补佐证之。工作模型为：缺Pi时miR399切OsPHO2 mRNA，OsHMGB1稳定→激活OsPTs/OsRNS3促再动员，同时OsPHF1/OsPP95/OsPHO1稳定促吸收转运，OsPHO2充当“刹车”平衡各环节。

结论部分翻译

综上，本研究证明OsPHO2通过泛素依赖降解调控OsHMGB1稳定性，以精细调节水稻Pi稳态。该模块将泛素介导蛋白周转与染色质层转录调控整合，塑造动态缺Pi响应，为Pi再动员机制提供新见解，并为提升水稻磷利用效率提供潜在策略。