《Plant Physiology and Biochemistry》：Transcriptomic and metabolomic analysis reveals key transcription factors regulating lignin biosynthesis in safflower hull
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摘要：红花（*Carthamus tinctorius* L.）作为一种极具开发潜力的油料作物，近期受到日益广泛的关注。红花瘦果的含油量以及后续油脂提取的效率，在很大程度上受果壳/果皮百分率（果皮重量占瘦果总重量的比例）的影响。然而，调控果壳发育的遗传机制在很
摘要：红花（*Carthamus tinctorius* L.）作为一种极具开发潜力的油料作物，近期受到日益广泛的关注。红花瘦果的含油量以及后续油脂提取的效率，在很大程度上受果壳/果皮百分率（果皮重量占瘦果总重量的比例）的影响。然而，调控果壳发育的遗传机制在很大程度上仍未被探明。在本研究中，研究人员对两个具有显著不同果壳百分率的红花品种——正常果壳（normal hull, NH）与薄果壳（thin hull, TH），进行了表型组学、代谢组学及转录组学分析。研究结果显示，NH品种较高的果壳百分率归因于其下皮层细胞体积更大以及次生细胞壁（secondary cell wall, SCW）更厚。代谢组学分析表明，在NH品种瘦果发育早期阶段，参与木质素生物合成的代谢物呈现出较高水平的积累。转录组数据进一步揭示，差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）富集于苯丙烷生物合成途径，且与木质素生物合成相关的基因在NH品种中的表达水平显著高于TH品种。加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）鉴定出turquoise模块为与果壳发育最显著相关的基因模块，并确定转录因子CtNAC043、CtNAC073a及CtMYB46是调控红花果壳发育过程中木质素生物合成的关键候选调控因子。在转基因红花毛状根中过表达*CtNAC043*、*CtNAC073a*和*CtMYB46*可显著提高木质素含量。此外，木质素生物合成基因的表达受CtNAC043、CtNAC073a和CtMYB46诱导上调。值得注意的是，在过表达*CtNAC043*的毛状根中，*CtNAC073a*和*CtMYB46*的表达水平亦上调。上述发现为阐明红花果壳发育过程中木质素生物合成的分子调控机制提供了见解，并为选育具有理想果壳百分率的红花品种奠定了基础。
基于转录组与代谢组联合分析的红花果壳木质素生物合成关键转录因子调控机制研究解读
**1. 研究背景与科学问题**
红花作为一种重要的油料作物，其瘦果由坚硬的果壳（果皮）和富含油脂的种仁（种子）构成。果壳在种子休眠调控、抵御机械损伤及生物与非生物胁迫中发挥关键作用，但过厚且坚硬的果壳也给榨油前的脱壳工序带来挑战。脱壳效率低下不仅加速榨油设备磨损、降低出油率，还会导致饼粕纤维含量升高、蛋白质含量降低，从而不适宜用作动物饲料。因此，降低果壳厚度对于优化油脂提取工艺具有重要意义。在油料作物中，含油量受胚大小及果皮或种皮厚度影响，通常较小的种子拥有较大的胚和较薄的果皮或种皮，从而获得更高的油脂回收率。在红花中，含油量与果壳百分率之间存在显著的负相关，尽管种质资源中已鉴定出多种果壳类型（如部分果壳、薄果壳和条纹果壳），但调控果壳发育的分子机制仍未被充分解析。
已有研究表明，瘦果果壳百分率在很大程度上受次生细胞壁形成的影响，而木质素是植物次生细胞壁的主要化学成分之一。在核桃、油茶、薏苡等多种植物中，果皮或种壳中的木质素含量与壳厚度呈显著正相关。因此，研究人员提出，调控木质素生物合成途径可能成为控制果壳百分率、进而提高红花瘦果含油量的有效策略。然而，红花果壳发育过程中木质素生物合成的转录调控机制尚不清楚，这成为开展本研究的重要动因。
**2. 研究技术与方法**
研究人员选取来自中国作物种质资源信息系统的两个具有对比果壳百分率的红花品种，即正常果壳（NH）品种（种质编号：ZHH00408）和薄果壳（TH）品种（种质编号：WHH00008），于河北工程大学上壁试验田种植，在花后多个时间点采集瘦果样本用于后续分析，每个实验条件设置三个生物学重复。研究采用了以下主要技术方法：（1）表型与组织学分析：利用体视显微镜、光学显微镜和透射电子显微镜观察果壳结构及下皮层细胞次生细胞壁厚度；（2）非靶向代谢组学分析：采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术对花后5、8、11天瘦果样本进行代谢物检测；（3）转录组测序：构建18个cDNA文库并在MGI平台测序，以红花参考基因组为参考进行比对和差异表达基因鉴定；（4）加权基因共表达网络分析（WGCNA）：利用差异表达基因构建共表达模块并与木质素相关代谢物进行关联分析；（5）系统发育分析：采用邻接法构建NAC和MYB转录因子家族系统发育树；（6）转基因功能验证：利用发根农杆菌K599菌株介导的毛状根转化系统对候选转录因子进行过表达验证，并通过组织化学染色、木质素含量测定及RT-qPCR进行功能鉴定。
**3. 研究结果**
**3.1 不同果壳百分率红花的表型特征**
研究首先通过种质资源数据分析确认了含油量与果壳百分率之间的显著负相关。对NH和TH两个品种的成熟瘦果进行比较发现，NH果壳厚度为0.29毫米，显著厚于TH的0.15毫米；NH果壳百分率为55%，而TH仅为26%。组织学观察显示，两个品种的果皮均由表皮层、下皮层、植黑色素层和厚壁组织层四层结构组成。在发育过程中，NH品种下皮层和厚壁组织从花后7天开始出现明显的次生细胞壁沉积，而TH品种至花后13天细胞壁增厚仍不明显。番红染色显示NH品种花后9天起下皮层和厚壁组织中有大量木质素积累。细胞学分析表明，两个品种果壳细胞层数无显著差异，但NH品种下皮层细胞尺寸显著大于TH品种。透射电镜观察进一步证实NH品种下皮层细胞壁厚度在各发育阶段均显著大于TH品种。木质素单体分析鉴定出G型和S型木质素为红花果壳中的主要木质素类型，两者在NH中含量均显著高于TH，而G/S比值在品种间无显著差异。这些结果表明，两个品种果壳百分率的差异主要归因于下皮层细胞大小和次生细胞壁厚度的不同。
**3.2 果壳厚度相关代谢物的鉴定**
代谢组学分析在三个发育阶段共检测到2346种代谢物。差异积累代谢物（DAMs）分析发现，在NH5对TH5、NH8对TH8和NH11对TH11三个比较组中分别鉴定出1075个、1201个和1260个DAMs，其中444个为三个比较组共有的差异代谢物。KEGG富集分析显示，苯丙氨酸代谢途径在花后5天被显著富集，该时间点恰与次生细胞壁快速合成阶段相吻合。对木质素生物合成途径相关代谢物的进一步分析表明，松柏醇、阿魏酸、肉桂酸甲酯和咖啡酸等关键代谢物呈现显著的阶段特异性积累模式，在花后5天含量高于花后8天和11天。其中，阿魏酸和松柏醇在NH中的积累量在所有发育阶段均显著高于TH。
**3.3 NH和TH品种的转录组分析**
转录组测序共获得9.155亿条有效读段，平均Q30和Q20值分别为98.82%和98.64%。差异表达基因分析在NH5对TH5、NH8对TH8和NH11对TH11三个比较组中分别鉴定出3236个、3152个和3375个DEGs，其中1123个为共有差异基因。KEGG富集分析显示，苯丙烷生物合成、次生代谢物生物合成、二芳基庚烷和姜辣素生物合成、黄酮生物合成以及脂肪酸降解等途径在所有三个比较组中均被一致显著富集，提示这些途径在红花果壳发育中发挥重要作用。
**3.4 木质素和纤维素生物合成相关基因的表达分析**
转录组数据中鉴定出多个木质素生物合成相关基因，包括3个CtPALs、2个CtC4Hs、3个Ct4CLs、2个CtCOMTs、2个CtF5Hs、2个CtCRRs、2个CtCADs、13个CtLACs和12个CtPODs。在两个品种中，大多数木质素生物合成基因的表达量均在花后5天达到峰值，随后逐渐下降。值得注意的是，这些基因在NH品种中的转录丰度在所有发育阶段均高于TH品种。纤维素合酶基因家族分析表明，大多数Csl家族基因在瘦果发育过程中表达水平较低，而CesA基因在两个品种中均表现出较高表达，其表达模式与木质素基因类似，在NH中表达水平一致高于TH。
**3.5 木质素生物合成相关模块的鉴定与富集分析**
利用WGCNA对428个DEGs进行分析，共生成13个共表达模块。模块与木质素生物合成相关代谢物（松柏醇、阿魏酸、咖啡酸和肉桂酸甲酯）的关联分析显示，turquoise模块基因的表达模式与这些木质素生物合成中间代谢物的积累动态高度相关。对该模块948个DEGs进行KEGG富集分析，发现其显著富集于次生代谢物生物合成、代谢途径、色氨酸代谢以及苯丙烷生物合成等途径。
**3.6 调控木质素生物合成的关键转录因子鉴定**
基于turquoise模块，研究人员构建了木质素生物合成结构基因与NAC/MYB家族转录因子之间的共表达调控网络。结果显示，4个NAC家族成员（CtAH01G0211600-NAC073、CtAH05G0176900-NAC073、CtAH01G0220000-NAC056和CtAH11G0149900-NAC043）和3个MYB家族成员（CtAH11G0241900-MYB46、CtAH06G0227900-MYB52和CtAH11G0230000-MYB103）是与木质素生物合成结构基因连接度最高的枢纽基因。表达模式分析表明，其中多个基因在NH品种瘦果发育各阶段表达水平一致高于TH，且在根和茎等木质化程度较高的器官中呈现特异性高表达。系统发育分析显示，CtAH11G0149900-NAC043与拟南芥NST1相近，CtAH01G0211600-NAC073与SND3相近，CtAH11G0241900-MYB46为AtMYB46的同源物。基于网络核心位置、发育表达模式和器官特异性表达，最终确定CtNAC043、CtNAC073a和CtMYB46为最有可能参与调控红花果壳木质化的候选转录因子。
**3.7 候选转录因子功能的验证**
在转基因红花毛状根中过表达CtNAC043、CtNAC073a和CtMYB46后，组织学观察显示木质部区域木质化细胞数量显著增加。木质素含量测定显示，对照根系木质素含量为5.89%，而OE-CtNAC043、OE-CtNAC073a和OE-CtMYB46转基因根的木质素含量分别显著升高至12.01%、13.71%和11.71%。RT-qPCR分析表明，多个木质素生物合成相关基因包括COMT1、CCoAOMT、4CL、F5H和POD10在过表达株系中均显著上调。特别值得注意的是，在过表达CtNAC043的转基因根中，CtMYB46和CtNAC073a的表达水平也显著升高，提示CtNAC073a和CtMYB46可能作为CtNAC043下游的转录调控因子发挥作用。
**4. 讨论与结论**
本研究通过比较具有对比果壳百分率的两个红花品种，在表型、代谢物、转录本和功能验证等多个水平上系统阐明了红花果壳发育过程中木质素生物合成的调控机制。在表型层面，红花果壳厚度差异主要由下皮层细胞大小和次生细胞壁厚度决定，这一发现与向日葵中厚壁组织占主导的果皮结构形成对比，揭示出红花果壳结构的独特性。在代谢层面，苯丙氨酸代谢途径的特异性富集和木质素相关代谢物的差异积累为果壳木质素含量的品种差异提供了代谢基础。在转录层面，WGCNA和共表达网络分析有效缩小了候选调控因子的筛选范围，最终锁定三个核心转录因子。功能验证不仅证实了这三个转录因子对木质素生物合成的正调控作用，还揭示出CtNAC043可能处于调控层级的上游，通过诱导CtNAC073a和CtMYB46的表达形成转录级联调控网络。基于上述发现，研究人员提出了红花果壳木质素生物合成的调控模型：CtNAC043作为主调控因子启动木质素生物合成途径，通过诱导下游CtNAC073a和CtMYB46的表达，进而激活木质素生物合成结构基因的转录。在NH品种中，这些转录因子表达水平较高，导致木质素生物合成基因的转录激活增强，最终形成较厚的果壳；而在TH品种中，这些转录因子表达水平较低，下游基因激活减弱，果壳百分率相应降低。
综上所述，本研究不仅揭示了红花果壳发育过程中木质素生物合成的转录调控机制，还为通过基因组编辑或利用自然/诱导突变来改良红花果壳性状、优化果壳百分率及提高含油量提供了理论依据和靶标基因。
