LeWRKY24靶向LeSAT2促进酰基紫草素生物合成的功能鉴定

《Plant Physiology and Biochemistry》：Functional characterization of LeWRKY24 targeting LeSAT2 to promote acylshikonin biosynthesis

　　

摘要翻译：
(R)-紫草素/(S)-阿卡宁及其衍生物（统称为紫草素类）广泛分布于紫草科植物根部。乙酰紫草素作为(R)-紫草素的重要衍生物，具有重要的研究意义。前期研究表明，LeSAT2特异性催化(R)-紫草素的酰化反应，生成包括乙酰紫草素在内的多种酰基化(R)-紫草素衍生物。此外，凝胶迁移率变动分析（EMSA）提示LeWRKY24转录因子可能参与LeSAT2的转录调控。本研究利用双荧光素酶报告基因（DLR）和酵母单杂交（Y1H）实验进一步验证了LeWRKY24与LeSAT2之间的相互作用。研究人员构建了LeWRKY24过表达载体并将其导入蓝蓟（Echium plantagineum）以诱导转基因毛状根。高效液相色谱（HPLC）分析结果显示，在过表达LeWRKY24的毛状根株系中，总色素含量显著增加，其中乙酰紫草素含量尤为显著，上调幅度高达200倍。转录组数据表明，过表达株系中与紫草素生物合成相关的基因显著上调，代谢途径被激活，这从分子机制上解释了该调控效应。研究结果还证实LeWRKY24在酰基紫草素生物合成中具有跨物种调控普遍性，为其在紫草科植物代谢工程中的广泛应用奠定了基础。

论文解读：

1. 研究背景与科学问题
紫草素类化合物是一类以5,8-二羟基-1,4-萘醌为核心的萘醌类天然产物，主要包括(R)-紫草素及其对映异构体(S)-阿卡宁，以及乙酰紫草素、异丁酰紫草素等酰化衍生物。已有研究表明紫草素具有抗炎、诱导癌细胞凋亡、抑制病原微生物（包括真菌、肠道病毒和SARS-CoV-2）等生物活性，其衍生物如乙酰紫草素和异丁酰紫草素在抗肿瘤、免疫调节及代谢疾病治疗方面也显示出应用潜力。其中乙酰紫草素作为(R)-紫草素的重要衍生物，具有较高的研究价值。其生物合成是在已确立的(R)-紫草素生物合成途径基础上，由BAHD家族酰基转移酶催化乙酰基转移至(R)-紫草素而完成。BAHD酰基转移酶家族在进化中功能多样化，参与挥发性酯类、花青素和黄酮类化合物生成，以及角质和木栓质形成等过程。在紫草（Lithospermum erythrorhizon）中已系统鉴定出73个LeBAHD家族成员，其中Le25525.1（LeBAHD56）被证实与LeSAT2序列一致，作为LeSAT1的同源物，可催化紫草素酰化反应生成乙酰紫草素。WRKY转录因子家族通过其N端保守WRKY结构域识别靶基因启动子中的W-box元件，在植物次生代谢调控中发挥核心作用。尽管已有研究确认WRKY家族在丹参酮、青蒿素等萜类化合物生物合成中的关键调控作用，但WRKY介导紫草素产生的分子机制尚不清楚。前期工作中，研究人员通过转录组测序和加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出与LeBAHD56（LeSAT2）显著共表达的候选转录因子，发现WRKY家族成员在根、茎、叶、花等组织中与LeSAT2呈现高度同步的时空表达模式；启动子顺式作用元件分析显示LeSAT2启动子区存在典型W-box结合位点；EMSA实验提供了LeWRKY24与LeSAT2启动子结合的分子证据。然而，乙酰紫草素生物合成的调控机制，特别是WRKY转录因子参与其调控网络的分子证据尚不完整。本研究旨在通过酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告基因（DLR）及转基因技术验证候选WRKY转录因子对LeSAT2的转录激活效应，阐明其在紫草素代谢途径中的多维调控网络。

2. 主要技术方法
研究人员选用紫草和蓝蓟（Echium plantagineum）作为实验材料。酵母单杂交（Y1H）实验中，将LeWRKY24 CDS克隆至pGADT7载体，LeSAT2及EpSATs启动子分别克隆至pAbAi或pHIS2载体，转化相应酵母菌株后在选择性培养基上验证蛋白-DNA互作。双荧光素酶报告基因（DLR）实验中，将LeWRKY24 CDS构建至pGreenII 62-SK效应载体，启动子构建至pGreenII 0800报告载体，共转化农杆菌GV3101（pSoup-P19）后瞬时侵染本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片，测定萤火虫荧光素酶（Fluc）与海肾荧光素酶（Rluc）活性比值。过表达载体构建采用pBI121-eGFP骨架，通过同源重组插入LeWRKY24，经发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）ATCC15834介导转化蓝蓟叶片外植体诱导转基因毛状根。采用高效液相色谱（HPLC）对毛状根及M9液体培养基中的总紫草素和酰基紫草素进行定量分析。转录组测序委托广州基迪奥生物科技有限公司完成，利用Illumina NovaSeq X Plus平台对6组样品（B5培养基中OE与EV、M9培养基3天OE与EV、M9培养基6天OE与EV）进行测序。凝胶迁移率变动分析（EMSA）中，LeWRKY24蛋白以GST融合形式在大肠杆菌Rosetta (DE3)中表达纯化，与Cy5标记的含W-box序列探针、突变探针及竞争探针孵育后经PAGE电泳检测。样本队列来源包括紫草红色根部cDNA、蓝蓟无菌苗叶片诱导的毛状根，以及不同培养条件下的转基因毛状根样品。

3. 研究结果
3.1 LeWRKY24与LeSAT2启动子的相互作用
酵母单杂交实验进一步验证了LeWRKY24与LeSAT2启动子区W-box顺式作用元件的互作，与前期报道一致，支持直接调控关系。DLR实验结果表明LeWRKY24显著增强LeSAT2的转录活性。EMSA、Y1H和DLR三种实验共同证明LeWRKY24通过结合LeSAT2启动子区激活基因表达。

3.2 表达LeWRKY24的毛状根诱导与鉴定
利用pBI121-eGFP空载体构建LeWRKY24过表达载体，通过发根农杆菌介导转化蓝蓟幼叶外植体诱导毛状根。PCR扩增毛状根基因组DNA中的rolB和rolC标记基因验证其转基因来源；利用35S-F和LeWRKY-OE-R引物检测LeWRKY24转基因存在，其中1–8号株系扩增阳性为过表达（OE）毛状根，9–16号株系无相应条带为空载体（EV）对照。共成功诱导17个EV株系和23个OE株系，选取生长旺盛的5个EV株系和8个OE株系用于后续实验。

3.3 LeWRKY24促进体内紫草素向酰基紫草素转化的功能验证
将转基因毛状根从B5生长培养基转移至M9生产培养基并暗培养，在0、1、3、6、9天观察色素积累。EV株系从第3天起检测到色素，第9天呈浅红色；OE株系第3天即呈现深红色，第6天达最大强度。HPLC分析检测到乙酰紫草素和β-羟基异戊酰紫草素在EV和OE株系中均存在。定量分析显示OE-2、OE-4和OE-11株系中(R)-紫草素/(S)-阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、脱氧紫草素/脱氧阿卡宁及总紫草素衍生物含量均显著高于EV-1对照。尤其值得注意的是，LeWRKY24过表达毛状根中乙酰紫草素含量约为空载体毛状根的200倍，增幅远高于其他紫草素衍生物，进一步证明LeWRKY24通过调控LeSAT2表达来调节酰基紫草素（特别是乙酰紫草素）生物合成。

3.4 OE毛状根中紫草素生物合成酶基因表达
对过表达和空载体毛状根进行转录组测序（测序深度≥10 Gb，Q30>90%），利用DESeq2算法进行差异表达分析（|log2FC|≥1，FDR<0.05）。B5培养基中共鉴定出9,099个差异表达基因（5,518个上调，3,581个下调）；M9培养基第3天鉴定出10,359个DEGs（5,139个上调，5,220个下调）；第6天鉴定出9,181个DEGs（4,945个上调，4,236个下调）。维恩图分析显示5,652个核心DEGs在三种条件下共同变化。GO富集分析表明DEGs在细胞过程、代谢过程、结合、催化活性等条目显著富集。KEGG富集分析显示代谢途径为最主要富集通路，其中苯丙烷生物合成在所有比较组中均显著富集。鉴于蓝蓟中紫草素生物合成相关酶基因尚未克隆和鉴定，研究人员基于基因组注释文件预测了HMGR、GPPS、PAL、C4H2、4CL、PGT、SAT等候选基因。在M9-3d和M9-6d比较组中，多个预测酶基因在OE株系中显著上调，包括与LePGT1同源的PGT基因（MSTRG_30692，下游途径关键起始酶）、甲羟戊酸（MVA）途径关键限速酶HMGR（EplaQFAX02000303_1G000130、EplaCM016562_1G011740），以及与LeSAT2同源的SAT基因（EplaCM016565_1G006770、EplaCM016565_1G006790、EplaQFAX02000349_1G000070等）。

3.5 LeWRKY24与EpSATs启动子结合验证
利用PlantCare数据库对12个EpSAT基因上游2000 bp序列进行顺式作用元件分析，发现5个基因（EplaCM016563_1G020270、EplaCM016565_1G006680、EplaCM016565_1G006770、EplaCM016565_1G006790、EplaQFAX02000349_1G000070）含有典型W-box基序。DLR实验证明LeWRKY24可结合EplaQFAX02000349_1G000070和EplaCM016565_1G006790启动子。Y1H实验用3-AT抑制自激活后验证了LeWRKY24与这两个启动子的结合。EMSA实验进一步确认LeWRKY24蛋白可结合上述启动子中的W-box序列。该结果与转录组数据中这两个基因在LE-OE株系中显著上调的表达模式一致，支持LeWRKY24通过调控SAT型酰基转移酶表达促进酰基紫草素生物合成的假设。

4. 讨论与结论
讨论部分围绕三个主题展开。其一，阐明酰基紫草素生物合成最后一步的转录开关。LeSAT2作为BAHD酰基转移酶家族成员，催化乙酰辅酶A依赖的酰化反应，是将紫草素转化为乙酰紫草素的关键步骤。基于WGCNA分析确定的“LeWRKY24-LeSAT2-酰基紫草素合成”级联调控机制，本研究通过Y1H、DLR和转基因实验再次证实LeWRKY24通过识别启动子W-box序列正向调控SAT2转录。蓝蓟中鉴定出12个与LeSAT2高度同源的EpSAT基因，其中含W-box的启动子将在后续研究中进一步验证。LeWRKY24还可能结合其他上游酶基因启动子，协同促进紫草素代谢。该发现与拟南芥中AtWRKY33调控硫代葡萄糖苷生物合成基因的机制相似，提示WRKY家族在次生代谢中的功能多样化可能源于底物驱动的适应性进化。其二，LeWRKY24-SAT2模块在紫草科属间的功能保守性。由于紫草转基因毛状根生长缓慢，本研究选择同属紫草科的蓝蓟进行功能验证。蓝蓟毛状根诱导效率高、扩增迅速，可作为研究紫草素生物合成调控机制的模型植物。将来自紫草的LeWRKY24导入蓝蓟后乙酰紫草素含量增加200倍，表明该转录因子在紫草科不同属间具有保守功能。研究还观察到PGT、HMGR、PAL、C4H等关键酶基因表达上调，提示LeWRKY24可能直接或间接调控这些途径基因。此外，在新疆紫草（Arnebia euchroma）和假紫草（Arnebia guttata）中SAT2与WRKY24表达呈强正相关，而在蓝蓟和祁州漏芦（Arnebia szechenyi）中无显著相关性，且前两种植物中紫草素和乙酰紫草素含量更高，表明种间紫草素含量差异与SAT2和WRKY24表达相关性密切相关。其三，LeWRKY24异源过表达系统激活代谢网络实现萘醌化合物高效积累。通过蓝蓟毛状根中异源过表达LeWRKY24实现乙酰紫草素的超量积累（200倍增加），揭示了跨物种代谢网络重编程机制。该基因可能通过双重途径重构宿主代谢系统：一是竞争性消耗共享前体香叶基焦磷酸，减少其流向竞争途径，引导代谢流转向紫草素生物合成；二是激活茉莉酸信号通路，诱导HMGR、PGT等关键基因协同上调。与单酶基因策略相比，转录因子实现的代谢网络系统激活效果显著，可能得益于宿主内源前体库优势和蓝蓟毛状根系统的代谢稳定性。该发现支持植物次生代谢模块化进化假说，即萘醌生物合成模块可能存在于紫草科共同祖先中，跨物种基因互补实验反向验证了其进化沉默机制。研究也存在一定局限性，主要集中于基因表达分析，缺乏靶向代谢组学数据，未来计划整合靶向代谢组学和蛋白质组学方法，系统解析调控网络。

结论部分翻译：本研究表明，LeWRKY24至少部分通过激活SAT2以及MVA和PP途径中的其他紫草素生物合成基因，显著促进酰基紫草素生物合成。LeWRKY24的功能表现出强烈的跨物种保守性，使其成为高效调控紫草素类生物合成的有前景的靶标基因。