虎杖（Reynoutria japonica）赖氨酸β-羟基丁酰化蛋白质组学全景图谱及其在硫化氢胁迫下的动态变化

《Plant Physiology and Biochemistry》：Proteome-wide Profiling of Lysine β-Hydroxybutyrylation in Reynoutria japonica (Huzhang) and Its Dynamics under Hydrogen Sulfide Stress

　　

虎杖（Reynoutria japonica）既是白藜芦醇的重要工业来源，也是一种以环境适应性强著称的药用植物。然而，其对关键环境信号分子硫化氢（H2S）的响应机制在很大程度上仍属未知。赖氨酸β-羟基丁酰化（Kbhb）是一种新近发现的短链脂肪酸酰化修饰，但其在调控植物胁迫响应中的作用尚不清楚。研究人员开展了虎杖中Kbhb的首次蛋白质组学全景分析，在6185个蛋白质上鉴定出17102个高置信度位点。基序分析揭示了6个保守基序。功能富集分析显示，Kbhb修饰蛋白主要参与核心碳与能量代谢，在乙酰辅酶A（acetyl-CoA）通量、β-羟基丁酸代谢以及白藜芦醇和蒽醌生物合成相关酶上广泛修饰。在NaHS施加的H2S胁迫下，短期暴露（3小时）引发活性氧（ROS）积累并提升全局Kbhb水平，尤其在组蛋白H3与H2A上，提示早期信号或染色质关联响应；长期暴露降低叶绿素含量并减少Kbhb丰度。药理抑制与植株内瞬时表达鉴定出RjapHDA5L与RjapHDA9L为调控Kbhb稳态的候选擦除酶。此外，酵母异源表达系统功能验证表明，通过β-羟基丁酸（BHB）或HDAC抑制剂提升Kbhb水平可显著增强三羧酸（TCA）循环关键酶异柠檬酸脱氢酶（IDH）的酶活性。这些发现表明Kbhb是核心代谢酶的功能激活剂。该研究提供了虎杖Kbhb的首个全局图谱，并为理解Kbhb动态如何调控环境胁迫下植物代谢与表观遗传适应奠定了分子基础。

研究背景方面，虎杖（Reynoutria japonica）作为白藜芦醇工业源与强环境适应性药用植物，其对硫化氢（H₂S）这一关键环境信号分子的响应机制鲜有研究。赖氨酸β-羟基丁酰化（Kbhb）虽在动物中已被证实参与代谢调控，但在植物中仅见零星报道，其在药用植物非组蛋白上的功能几乎空白。鉴于虎杖可在富H₂S火山环境存活，研究人员推测Kbhb可能介导热胁迫下的代谢与表观遗传适应，从而开展此项首个体内蛋白质组学普查。

主要关键技术方法包括：以湖北十堰秦巴山区采集的虎杖种子繁育40天苗为材料，经600 μM NaHS模拟H₂S胁迫（3、6、12小时）处理；采用高分辨LC-MS/MS（timsTOF Pro 2，PASEF模式）结合抗Kbhb泛抗体亲和富集绘制修饰位点；通过MoMo（motif-x）进行序列偏好分析；依托eggNOG、KEGG、GO与STRING开展功能与互作注释；以Trichostatin A（TSA）药理抑制及本氏烟瞬时过表达候选HDACs验证擦除功能；在酵母BY4741中异源表达虎杖IDH（Rjap020g24320.3），用BHB与NaBt提升Kbhb后测酶活。样本队列为三重复40天幼苗及对应胁迫时序组。

研究结果各小节结论如下：

3.1 节全局定位显示，三重复交集3468蛋白、并集6185蛋白，共17102个高置信Kbhb位点，83.1%肽段带修饰，确认Kbhb在虎杖蛋白组中广泛存在。

3.2 节基序与二级结构分析鉴定6个显著保守基序，修饰位点偏好A/G/H/L/T/V/Y侧翼，富集于β折叠与随机卷曲、溶剂可及性略低，提示柔性埋藏微环境。

3.3 节功能注释表明修饰蛋白集中于PTM与伴侣（685）、翻译（462）、糖转运（407）；GO中代谢过程最显；KEGG主打碳水（649）、氨基酸（424）、能量（312）代谢；亚细胞定位于叶绿体38.03%、细胞质29.35%、核15.83%。

3.4 节富集分析进一步锁定尼克酰胺与吡啶核苷酸合成、丙酮酸代谢、谷胱甘肽转移酶域及TCA、光合、糖酵解通路，PPI显示碳固定与TCA模块高度成团。

3.5 节与微藻Nannochloropsis oceanica比较获773直系同源修饰蛋白（占虎杖14.3%），基序部分共有部分特异，提示保守与物种特异并存。

3.6 节锁定乙酰辅酶A中枢：TCA中ACO、IDH、α-KGDH、SCS、FH高修饰；光合电子链与F型ATP酶广布；次生代谢中PAL、C4H、4CL、CHS/STS/PKS均带Kbhb，牵连白藜芦醇与蒽醌合成。

3.7 节H₂S动态示3小时ROS峰、叶绿素降、全局Kbhb升（H3/H2A最敏），6—12小时回落；qPCR示短期HAT下调、部分HDAC上调另部分下调，指向动态调控。

3.8 节TSA抬升全局Kbhb；系统发育选RjapSRT2L、RjapHDA5L、RjapHDA9L，烟草瞬时过表达仅RjapHDA5L与RjapHDA9L显著降低Kbhb，定为候选擦除酶，分别定位于质核与线粒体叶绿体。

3.9 节酵母中BHB/NaBt升IDH-Kbhb且IDH酶活显著增强，证明Kbhb对TCA酶具正向前馈激活。

讨论部分总结：研究人员指出虎杖Kbhb位点数远超微藻与水稻花，暗示物种扩张；叶绿体型分布为植物特有。H₂S短时促Kbhb、长时抑，可能与ROS与光合受损伴行。RjapHDA5L/HDA9L归类Class I/II HDAC，与动物SIRT3/Class I擦除逻辑部分保守。IDH案例将Kbhb从相关推向功能调节者，呼应动物CS/MDH2被Kbhb激活的范式。

结论部分翻译：本研究提供了药用植物虎杖中赖氨酸β-羟基丁酰化（Kbhb）的首个高分辨蛋白质组全景图谱。研究发现Kbhb是一种广泛且保守的修饰，优先靶向核心代谢酶及能量稳态相关蛋白（如TCA循环与光合中蛋白）。通过整合蛋白质组、药理与异源功能实验，研究人员证明Kbhb不仅是结构修饰，更是酶效的功能调节者，异柠檬酸脱氢酶（IDH）活性增强即其例证。此外，研究揭示了H₂S响应与Kbhb动态调控的潜在联结，并鉴定RjapHDA5L与RjapHDA9L为候选HDAC擦除酶，提示Kbhb或参与虎杖代谢与表观遗传调控。结果拓展了PTM贡献于药用植物环境适应性的认知。未来需位点突变与CRISPR/Cas9体内验证、探究Kbhb与乙酰化/琥珀酰化互作，以解构白藜芦醇等次生代谢的“PTM密码”。论文发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。