《Plant Physiology and Biochemistry》：Loss of UBIQUITIN-PROTEIN LIGASE 3 (UPL3) impairs cellulose-xylan structural organization in
Arabidopsis seed mucilage
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拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）种子会释放出大量的黏液质多糖胶囊，其黏附性不仅依赖于纤维素和半纤维素的生物合成，还取决于它们之间的相互作用。然而，调控种子外壳黏液质中这一多糖网络连接的关键蛋白仍不明确，需要进一步研究。通过反向遗传学
拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）种子会释放出大量的黏液质多糖胶囊，其黏附性不仅依赖于纤维素和半纤维素的生物合成，还取决于它们之间的相互作用。然而，调控种子外壳黏液质中这一多糖网络连接的关键蛋白仍不明确，需要进一步研究。通过反向遗传学方法，研究人员证明了定位于细胞核的HECT型E3连接酶蛋白UBIQUITIN-PROTEIN LIGASE 3（UPL3）是种子外壳黏液质中纤维素射线正确组织所必需的。UPL3的功能缺失导致种子黏液质晕圈增大，并伴随伸长且弥散染色的纤维素结构，但不影响果胶聚合物的生物合成、结构及化学组成。此外，在upl3突变体种子中，木聚糖的分布而非生物合成受到显著影响。遗传分析揭示，upl3突变可部分抑制纤维素合酶5（cellulose synthase 5，CESA5）基因突变导致的黏液质缺陷，并能完全恢复不规则木质部7（irregular xylem 7，IRX7）突变体的黏液质表型，但不能恢复黏液质修饰5（mucilage modified 5，MUM5）及IRX14突变体的表型。研究结果表明，UPL3在木聚糖组织（并可能在irx7突变体背景下参与木聚糖合成）中发挥调控作用，并且对于维持纤维素与木聚糖的正确共同组织至关重要，这很可能对它们在黏液质结构中的功能性互作具有重要意义。
**论文解读文章**
**研究背景与科学问题**
种子外壳黏液质是植物种子表皮细胞分泌至胞外的一种特有细胞外基质结构（?ola et al., 2019）。在拟南芥中，该结构由种子表皮最外层细胞在开花后7至10天合成并分泌。黏液质吸水膨胀后会形成由外层可溶性黏液层（SM）和内层黏附性黏液层（AM）组成的双层结构，其中AM层含有纤维素射线（Western et al., 2001; Macquet et al., 2007）。AM层主要由鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I（RG-I）构成，同时含少量纤维素、半纤维素（包括半乳糖葡甘露聚糖和木聚糖）及同聚半乳糖醛酸（HG），这些多糖共同参与黏液质的黏附过程（Sullivan et al., 2011; Yu et al., 2014; Voiniciuc et al., 2015b; Hu et al., 2016a, 2016b; Ralet et al., 2016; Ding et al., 2021）。此前以种子黏液质为模型的研究已鉴定出两条介导多糖相互作用的通路：其一涉及纤维素合酶5（CESA5）与黏液质修饰5（MUM5）/黏液质相关21（MUCI21），该通路中纤维素与木聚糖对于黏液质黏附至关重要；其二涉及盐超敏感5（SOS5）与FEI2，通过将纤维素组织为射线结构发挥作用（Griffiths et al., 2016）。尽管已有上述进展，调控黏液质中纤维素与木聚糖等多糖网络连接的关键蛋白及其作用机制仍不清楚。HECT型E3连接酶UBIQUITIN-PROTEIN LIGASE 3（UPL3）此前被鉴定为调控表皮毛发育的关键因子（Perazza et al., 1999; Downes et al., 2003; El Refy et al., 2003），并陆续被发现参与植物次生壁发育、免疫、叶片衰老及种子大小调控等过程（Bensussan et al., 2015; Furniss et al., 2018; Miller et al., 2019; Lan et al., 2022; Wang and Spoel, 2022）。然而，UPL3及其最相近旁系同源物UPL4在种子黏液质多糖合成与发育中的具体功能尚未明确。本研究旨在探究UPL3是否参与调控拟南芥种子黏液质中纤维素-木聚糖网络的结构组织，从而深化对黏液质结构形成调控机制的理解。该研究由烟草研究所（中国农业科学院）研究人员完成，发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。
**主要技术方法**
研究人员利用拟南芥Columbia-0生态型为野生型对照，从诺丁汉拟南芥种质资源中心及合作者处获取了upl3-1、upl3-3、upl4-1、upl4-2、cesa5-3、mum5、mum2-10、sos5-2、fei2-2、fly1-3、irx7及irx14-1等突变体材料，并通过杂交构建了多个双突变体。研究综合运用了以下关键技术：通过qRT-PCR分析UPL3等基因在不同发育阶段的表达模式；利用GFP融合蛋白进行亚细胞定位观察；采用番红红（RR）和庞塔明快红4B（S4B）染色结合共聚焦显微镜分析黏液质形态；通过高效液相色谱（HPLC）、高效凝胶渗透色谱（HPGPC）和气相色谱-质谱联用进行单糖组成、分子量及糖基连接分析；运用免疫标记技术（CCRC-M36、CCRC-M139、JIM5抗体及CBM3a纤维素结合模块）检测RG-I、木聚糖、HG及结晶纤维素的分布；利用偏光显微镜评估结晶纤维素有序性；并结合定量蛋白质组学（LC-MS/MS）筛选UPL3相关的差异表达蛋白。
**研究结果**
**3.1 UPL3在种子黏液质合成期间的表达模式**
qRT-PCR分析显示，UPL3、CESA5和IRX7在种子中的转录水平从4 DPA到13 DPA逐渐上升。UPL3和IRX7在13 DPA达到表达峰值，而CESA5在10 DPA时已达到峰值，与先前报道一致。微阵列数据表明这三个基因在黏液质合成期间于种子外壳中共表达。亚细胞定位实验显示，UPL3-GFP融合蛋白的绿色荧光信号主要定位于细胞核中。上述结果支持UPL3在黏液质产生和积累中的潜在作用。
**3.2 UPL3突变导致黏液质胶囊增厚**
研究人员对upl3-1和upl3-3两个独立T-DNA插入突变体进行了RR染色分析。在剧烈振荡条件下，upl3突变体种子的AM层面积较野生型增加约40%，且这一表型可被p35S:UPL3-GFP构建体完全互补，证明该表型源于UPL3功能缺失。相比之下，UPL4的两个突变体upl4-1和upl4-2表现出与野生型一致的黏液质表型，且upl3-1 upl4-1双突变体的黏液质胶囊大小与upl3-1单突变体类似，表明UPL3与UPL4在种子黏液质建成中不具有功能冗余性。
**3.3 UPL3突变不影响果胶的生物合成、结构及SM与AM层间的分布**
对顺序分离的SM和AM层进行单糖组成分析，发现upl3与野生型之间在单糖组成或总糖含量上均无显著差异。HPGPC分析显示，野生型与upl3的SM和AM层糖分子量分布特征一致。糖基连接分析进一步表明，upl3黏液质的总多糖组成及其化学键合结构与野生型基本一致，其中鼠李糖残基2-Rha与半乳糖醛酸残基4-GalA摩尔比接近1:1，构成RG-I主干。值得注意的是，末端木糖（t-Xyl）和4-木糖（4-Xyl）残基在upl3与野生型间无显著差异，支持木聚糖生物合成未受影响。
**3.4 UPL3为纤维素射线结构的组织所必需**
利用纤维素特异性荧光染料S4B染色发现，野生型种子呈现有序且强烈的纤维素射线信号，而upl3种子保留大部分弥散染色的纤维素结构，纤维素射线明显减弱，且弥散纤维素结构之间存在间隙。总纤维素含量和结晶纤维素含量在upl3种子黏液质中与野生型相当。CBM3a免疫标记显示，upl3种子的“胡须尖端”状结构较野生型明显变小，且CBM3a信号距离种子表面更远；同时在upl3种子中可检测到沿AM层分布的清晰CBM3a标记“射线”，而野生型中很少见。偏光显微镜分析表明，upl3种子表现出更大的双折射区域且亮度高于野生型，表明结晶纤维素微纤丝的排列发生变化。
**3.5 UPL3突变改变AM层中黏液质果胶的空间分布**
CCRC-M36免疫标记实验显示，野生型和upl3种子中RG-I信号主要位于纤维素结构的外缘，但upl3种子中CCRC-M36标记组分距种子表面的距离较野生型更远，且沿纤维素分布的弥散染色更强。JIM5抗体标记结果进一步表明，野生型中低甲酯化HG信号主要分布于纤维素射线之间，而upl3中信号额外沿弥散、伸长的纤维素结构分布。这些结果与单糖组成和糖基连接分析中果胶总量未变的结果相结合，表明UPL3突变主要影响果胶的空间分布而非其合成。
**3.6 UPL3突变影响柱状体发育**
扫描电镜观察显示，upl3突变体种子的表皮细胞面积与野生型无显著差异，但柱状体（columella）顶部表面积约为野生型的1.5倍，相应地黏液质囊腔体积减小。该结果与使用70-kD FITC-dextran分子进行的孔隙率分析结果一致。
**3.7 upl3产生更厚的黏液质胶囊与钙介导的膨胀无关**
70-kD FITC-dextran渗透实验表明，upl3种子的AM层结构并未疏松到允许该分子进入的程度。EDTA和CaCl2预处理实验显示，在去除钙离子（EDTA处理）或增加钙离子（CaCl2处理）的条件下，upl3种子的AM层厚度仍显著大于野生型，表明upl3黏液质表型与钙介导的膨胀机制无关。
**3.8 UPL3突变部分恢复cesa5而非sos5和fei2的黏液质缺陷**
通过构建upl3-1 cesa5-3、upl3-1 sos5-2和upl3-1 fei2-2双突变体并分析其黏液质表型，发现upl3-1 cesa5-3双突变体的黏液质缺陷较cesa5-3单突变体有所减轻，表现为AM层厚度增加，表明upl3可部分恢复cesa5-3的黏液质缺陷。CBM3a、CCRC-M36和JIM5标记及双折射分析进一步证实了这种部分恢复效应。相比之下，upl3-1 sos5-2和upl3-1 fei2-2双突变体的黏液质表型分别与sos5-2和fei2-2单突变体相似，说明upl3不能恢复这两个突变体的表型。S4B染色显示，upl3-1 cesa5-3双突变体种子表面产生了比cesa5-3更长、更强的纤维素射线。
**3.9 UPL3对木聚糖的组织至关重要**
upl3-1 mum5和upl3-1 irx14-1双突变体的黏液质表型分别与mum5和irx14-1单突变体相似；而upl3-1 irx7双突变体表现出与upl3-1单突变体相同的黏液质表型，表明upl3可完全抑制irx7的黏液质缺陷，UPL3在遗传上位性上作用于IRX7。CCRC-M139免疫标记显示，野生型种子中木聚糖信号沿纤维素射线分布，而upl3种子中木聚糖呈现弥散分布模式；upl3-1 irx7双突变体中木聚糖分布模式被恢复为与upl3-1相似的弥散模式。糖基连接分析表明，upl3-1 irx7双突变体的木聚糖单糖残基组成恢复到野生型和upl3-1的水平，而irx7单突变体中t-Xyl、2-Xyl、4-Xyl和2,4-Xyl显著降低。
**3.10 UPL3突变改变fly1的黏液质挤压模式**
upl3-1 mum2-10双突变体与mum2-10单突变体一致，均无法释放黏液质。upl3-1 fly1-3双突变体在剧烈振荡条件下，RR染色显示其黏液质晕圈显著大于fly1-3单突变体，且fly1-3的外围盘状结构（由表皮细胞初生壁脱离形成）完全消失。S4B染色证实这些盘状结构位于纤维素射线末端，在upl3-1 fly1-3双突变体中完全缺失。Na?CO?预处理后，upl3-1 fly1-3种子的黏液质晕圈大小接近野生型。
**3.11 蛋白质组学分析揭示UPL3相关多糖代谢的潜在蛋白**
定量蛋白质组学共鉴定出395个差异表达蛋白（DEPs），其中在upl3-1中上调252个、下调143个。在被上调的DEPs中，21个为细胞核相关蛋白，18个为细胞壁相关蛋白。其中果胶甲酯酶16（PME16）、PME31和果胶甲酯酶抑制子6（PMEI6）的丰度分别增加1.95、1.54和1.54倍；漆酶5（LAC5）和LAC17分别增加1.5和5.5倍；IRX15L在野生型中几乎检测不到，而在upl3-1中显著积累。qRT-PCR验证显示，PMEI6、IRX15L、LAC7和IQD10在转录水平显著上调，而IRX7、PME16、PME31、GATA28和LAC5的转录水平无变化，表明后者可能受到UPL3的翻译后水平调控。
**结论**
本研究确立了HECT型E3连接酶UPL3在调控拟南芥种子外壳黏液质中纤维素射线结构形成及细胞壁聚合物（包括纤维素和木聚糖）高阶组织中的关键作用。遗传分析进一步揭示，upl3突变可通过补偿木聚糖生物合成来完全恢复irx7突变体的黏液质缺陷，但不能恢复irx14或mum5的缺陷，这表明UPL3在木聚糖合成中具有重要功能，尤其是在缺乏葡糖醛酸木聚糖特征性四糖RES的植物中。蛋白质组学与qRT-PCR分析鉴定了该通路中潜在的下游靶标，值得进一步研究。综上，该研究为这一特化胞外基质中调控木聚糖合成和细胞壁聚合物组织的新型调控通路提供了见解。
