1-MCP 和蔗糖处理通过调节关键自噬基因 BrATG7 维持采后小白菜叶绿体蛋白活性

《Postharvest Biology and Technology》：Maintenance of chloroplast protein activity in postharvest pakchoi by 1-MCP and sucrose treatments through the regulation of the key autophagy gene BrATG7

　　

1. 1-MCP与蔗糖互补性延迟上海青采后衰老。2. BrATG7表达与品质劣变相关，并受MST抑制。3. BrATG7过表达损害RuBisCO活性并将自噬与叶绿体降解联系起来。4. BrNAC29促进BrATG7的转录。1. 引言上海青（Brassica rapa subsp. chinensis）因其生长周期短、口感脆嫩、风味独特而成为广泛消费的叶类蔬菜。然而，在常温条件下，其采后货架期受水分快速散失和叶片黄化严重限制，导致显著的经济损失。为缓解上述问题，已探索了多种保鲜策略。例如，据报道，用硫化氢（H?S）或1-甲基环丙烯（1-MCP）熏蒸（Song等，2023a；Yu等，2024a），以及用褪黑素、赤霉素（GA）和6-苄氨基嘌呤（6-BA）处理（Song等，2025a；Song等，2023b；Song等，2025b），均可延迟衰老。1-MCP是乙烯受体的竞争性抑制剂，通过阻断乙烯感知，抑制下游信号传导，降低呼吸速率，延迟叶绿素降解，并增强采后蔬菜的抗氧化能力（Song等，2024；Yang等，2024）。此外，1-MCP也可能通过吸附作用吸附到非受体物质上（Choi and Huber, 2009；Dong等，2019；Lee等，2012）。另一方面，蔗糖作为一种外源碳源，可缓解采后碳饥饿，维持基础能量代谢，稳定细胞结构，并减少活性氧的积累（Luo等，2025；Romero等，2020）。这些机制截然不同却互补——1-MCP主要作用于乙烯信号传导和氧化应激，蔗糖则补充能量状态并缓解饥饿——使二者的组合成为品质维持的有力策略。值得注意的是，1-MCP与蔗糖的联合处理有效延迟了采后叶类蔬菜的衰老（Guo等，2024）。尽管该联合处理效果显著，其背后的分子机制仍基本未被探索。自噬是一种高度保守的降解途径，由自噬相关（ATG）基因介导。在植物中，自噬可被多种胁迫条件诱导，包括碳饥饿、黑暗和氧化应激——这些正是叶类蔬菜脱离土壤后立即面临的挑战（Cheng等，2025；Mcloughlin等，2020）。在叶片衰老过程中，多个ATG基因的表达显著上调（Breeze等，2011）。自噬在衰老过程中发挥双重作用。基础水平的自噬有助于清除受损的蛋白质和细胞器、回收营养物质并减轻氧化应激，从而延迟衰老。然而，过度的自噬活性会加速功能细胞组分（包括叶绿体）的降解，主动促进衰老进程（Oikawa等，2022；Roni等，2022；Zeng等，2025a）。在ATG基因中，ATG7编码一种对自噬体形成至关重要的E1样激活酶，是介导自噬膜扩张的两种类泛素共轭系统所必需的（Kaiser等，2012；Kaiser等，2013；Minina等，2018）。ATG7代表自噬通量的限速步骤，其表达在胁迫和衰老过程中受到精密调控（Hashimi等，2023；Minina等，2018）。NAC转录因子是植物叶片衰老和胁迫响应的已知调控因子（Han等，2023）。多个NAC成员可直接激活衰老相关基因，包括参与叶绿素降解和活性氧代谢的基因（Oda-Yamamizo等，2016；Zhu等，2020）。在叶片中，NAC转录因子调控采后品质劣变（Li等，2023；Li等，2025）。新兴证据表明，NAC转录因子在胁迫条件下也可能调控自噬相关基因（Broda等，2021）。然而，NAC转录因子是否在叶片衰老过程中直接调控ATG7等关键自噬基因，目前仍知之甚少。本研究旨在探究1-MCP与蔗糖对上海青叶片采后品质和叶绿体代谢的联合效应，并确定这些保鲜效果是否通过BrATG7依赖性自噬介导。我们对多个自噬相关基因的转录水平进行了分析，并选择BrATG7进行生物信息学分析和在上海青中的过表达功能表征。为探索上游调控机制，我们还检测了转录因子BrNAC29，其可能调控BrATG7的表达。本工作可为采后衰老延迟提供机制性见解，并为叶类蔬菜品质维持识别潜在的分子靶点。2. 材料与方法2.1. 植物材料与处理采收7周龄的上海青植株后立即运至实验室（标记为第0天）。选取鲜重120±30 g且无机械损伤或病害的植株，分为四组，放入密封泡沫箱中，每箱配备底部托盘。处理方案如下：对照组（CK），托盘内注入蒸馏水以浸没根部；1-MCP处理组（MT），在封箱前向箱内加入1-MCP水溶液，使其最终熏蒸浓度达到5 μL·L?1，托盘内注入蒸馏水以浸没根部；蔗糖处理组（ST），托盘内注入12%（w/w）蔗糖溶液以浸没根部；联合处理组（MST），按MT方案进行1-MCP熏蒸，同时按ST方案在托盘内注入12%蔗糖溶液。为防止CO?积累，每箱内放置一根装有10%（w/w）NaOH溶液的开管。12小时后开箱，轻柔冲洗根部并风干至表面无残留水分。所有样本随后分别装入黑色聚乙烯袋中，在20 °C、90±5%相对湿度条件下贮藏7天，于第0、1、3、5和7天取样。采集最外层和次外层叶片用于分析。未立即使用的样本进行液氮速冻后于?80 °C保存待用。2.2. 生理与生化分析除特别说明外，本节所有生理和生化指标均基于样本鲜重（FW）计算。2.2.1. 基本生理参数整株植株进行拍照和称重以计算失重率。使用色差计测量次外层叶片的叶色。呼吸速率测定方法为：将样本置于黑暗条件下的气密室中2 h，根据CO?浓度的变化计算呼吸速率（Song等，2023a；Yu等，2024a）。2.2.2. 氧化应激参数丙二醛（MDA）含量通过硫巴比妥酸反应法测定，以μmol·g?1表示（Hassan等，2020）。超氧阴离子（O2•?）生成速率通过羟胺氧化法测定，以μmol·kg?1·min?1表示（Luo等，2015）。超氧化物歧化酶（SOD）活性基于560 nm处的吸光度变化测定，以103 U·kg?1表示（Xie等，2022）。2.2.3. 叶绿素含量及叶绿素降解相关基因表达从新鲜叶片样本中提取叶绿素。在4 °C预冷的研钵中研磨样本，逐渐少量加入95%（v/v）乙醇直至组织完全变白。匀浆离心去除不溶物，测定上清液在645 nm和663 nm处的吸光度。叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量使用标准公式计算，以mg·g?1表示（Wang等，2022）。叶绿素降解相关基因BrCLH、BrPPH和BrNYC1的表达通过RT-qPCR分析。使用RNA分离试剂盒（9769，TaKaRa）提取总RNA，并用cDNA合成试剂盒（RR047A，TaKaRa）反转录为cDNA。在QuantStudio 5实时PCR系统上进行RT-qPCR，以BrActin作为内参基因。引物基于从NCBI数据库获取的mRNA序列设计。以第0天表达水平作为校准值，使用2?ΔΔCT方法计算相对表达量。具体引物列于表S1。2.2.4. 蛋白质含量与酶活性总蛋白含量使用BCA法测定，以mg·g?1表示。总蛋白酶活性使用偶氮酪蛋白作为底物测定，以U·mg?1总蛋白表示（Xie等，2022）。RuBisCO活性按试剂盒说明书（BC0440，Solarbio）测定，结果以U·g?1表示。2.2.5. 叶绿体超微结构观察在第0、3和7天，从叶片中间区域（避开主脉和叶缘）采集次外层叶片的横切组织（1 cm × 0.5 cm），经2.5%戊二醛固定24 h后，冲洗、 postfix、脱水、树脂浸透、包埋和切片。在加速电压80 kV的透射电子显微镜下观察（Velikova等，2015）。2.3. 生物信息学分析上海青基因组数据从十字花科数据库（Chen等，2022）下载。为鉴定上海青中的BrATG基因家族成员，以拟南芥和水稻的ATG蛋白序列为查询序列，对上海青基因组进行BLASTP搜索。候选基因随后通过保守结构域分析进行验证。使用Expasy ProtParam工具预测ATG蛋白的理化性质。后续分析包括序列分析和进化分析。使用TBtools（Chen等，2023）提取每个鉴定基因的启动子序列。使用PlantCARE数据库预测这些启动子中的顺式作用调控元件，并按其推定功能分类。使用热图可视化这些元件在各基因间的分布。利用PlantRegMap数据库（http://plantregmap.gao-lab.org/）（Tian等，2020）预测BrATG7启动子中上游调控因子的可能结合位点。2.4. 分子生物学分析2.4.1. BrATG7克隆与序列分析将BrATG7基因及其启动子区域BrATG7-Pro克隆至Blunt Simple载体中，转化至大肠杆菌DH5α菌株。使用基因特异性引物通过Sanger测序验证序列。使用SOPMA、TMHMM-2.0和SWISS-MODEL预测蛋白结构。2.4.2. 亚细胞定位实验将BrATG7和BrNAC29的CDS通过SpeⅠ和SmaⅠ双酶切克隆至pCAMBIA-1305载体中。随后，将BrATG7重组质粒连同相应的标记物转化至拟南芥原生质体。使用Nikon共聚焦激光扫描显微镜（Nikon AX）观察荧光信号。同一构建体也在烟草叶片中转瞬时表达（ZEISS LSM900）。将重组质粒pBrNAC29-1305-GFP转化至大肠杆菌DH5α进行扩增，提取后转化至含有pSoup-p19的根癌农杆菌GV3101菌株。为进行转化，将携带重组质粒的农杆菌GV3101菌株在含卡那霉素和利福平的LB培养基中于28 °C、200 rpm振荡培养至对数生长期。收集细胞，用含10 mmol·L?1 MgCl?、150 μmol·L?1 AS和10 mmol·L?1 MES的缓冲液洗涤两次，并重悬至OD???为0.6–0.8。菌悬液在黑暗中28 °C孵育3 h，然后用无针注射器将菌悬液注射至5周龄烟草叶片背面。注射后的植株在黑暗中培养24 h，再在弱光（5000 lux）下培养24 h。孵育48 h后使用共聚焦显微镜观察荧光并采集图像。以HSBP-mKate2作为BrATG7的细胞质标记，AtH2B-mCherry作为BrNAC29的细胞核指示物（Sun等，2026；Wang等，2024）。2.4.3. BrATG7瞬时过表达克隆BrATG7的CDS（表S1），插入pCAMBIA-1305载体，转化至根癌农杆菌GV3101菌株后于28 °C培养至OD???=1.0。将菌液重悬于注射缓冲液中，用无针注射器缓慢将5.0 μL菌液注入5周龄上海青中（Jia等，2024）。在黑暗中保存24 h后，再在弱光（5000 lux）下暴露24 h，然后采集植物组织。注射空载体的植株作为对照。在烟草中进行异源过表达时，按2.4.2节所述程序将相同农杆菌菌悬液注射至烟草叶片中。测定注射上海青和烟草组织中的RuBisCO活性。2.4.4. 双荧光素酶报告基因实验扩增BrNAC29的CDS并导入pGreenⅡ-62SK载体；另一方面，将BrATG7启动子片段插入pGreenⅡ-0800-LUC载体，构建报告基因。随后，将含有pGreenⅡ-62SK-BrNAC29载体的农杆菌与报告基因混合后注射至烟草叶片中。使用双荧光素酶报告基因检测系统（Promega Corp.，美国威斯康星州麦迪逊市）测定LUC和REN活性（Wang等，2026a）。含有空pGreenⅡ-62SK载体和报告基因的转化体作为对照。具体引物列于表S1。2.4.5. ChIP-qPCR用于ChIP-qPCR的BrNAC29过表达上海青组织按2.4.3节所述农杆菌介导的瞬时转化方案制备。注射后48 h采集注射区域组织用于后续交联。

在匀浆化和细胞裂解后，获得染色质，随后进行超声处理，生成可溶性的剪切染色质片段，平均长度为200–500 bp。其中一部分作为输入DNA，另一部分则使用抗GFP抗体（Ab290，Abcam）进行免疫沉淀。BrATG7启动子片段的富集程度通过qPCR检测进行评估。含空pCAMBIA-1305载体的转化体作为对照。引物序列见表S1.2.5。

**2.5 数据分析**

所有测量至少进行三次生物学重复，数据以均值±标准差表示。统计分析使用RStudio进行。p < 0.05的差异被视为显著差异。图表使用Origin 2022.3生成。

**3. 结果**

**3.1 采后品质指标**

在储存后期，对照组（CK）出现明显的叶片黄化和根部失水现象，而三种处理（MT、ST和MST）均显著缓解了这些症状（图1A）。储存前期各组间失重率无显著差异；但在第7天，CK组的失重率急剧上升，显著高于各处理组（图1B）。在整个储存期间，所有处理组的呼吸速率均显著低于CK组。其中MT组抑制效果最强，MST组次之，ST组虽有效但随时间变化的波动较大（图1C）。

 图1. 小白菜在20℃下储存7天期间的外在品质（A）、失重率（B）、呼吸速率（C）、b值（D）、MDA含量（E）、O?•?生成速率（F）和SOD活性（G）。数据以均值±标准差表示（n = 3）。同一时间点不同字母表示CK、MT、ST和MST之间存在显著差异（p < 0.05）。

b值是衡量黄化的指标，其变化进一步证实了各处理延缓品质劣化的效果（图1D）。第7天，MST组的b值仅为CK组的46.04%。MDA含量是膜脂质过氧化程度的指标，在储存期间CK组的MDA含量持续升高，而所有处理组在储存末期的MDA含量均显著低于CK组（图1E）。O?•?生成速率呈类似趋势（图1F）。关于SOD活性，ST组早在第1天就表现出比CK组显著升高，而MST组在整个储存期间维持较高的SOD活性，后期差异更为明显（图1G）。

**3.2 叶绿素含量及叶绿素降解相关基因表达**

储存期间，所有组中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均逐渐下降（图2A–C）。第7天，CK组的总叶绿素含量仅为初始水平的65.87%。RT-qPCR分析显示，叶绿素降解相关基因BrCLH、BrPPH和BrNYC1在CK组中表达显著上调，而三种处理均显著抑制了它们的转录（图2D–F）。

 图2. 小白菜在20℃下储存7天期间叶绿素a含量（A）、叶绿素b含量（B）、总叶绿素含量（C）、BrCLH（D）、BrPPH（E）和BrNYC1（F）的相对表达量，以及CK和MST组在第0、3、7天的最外层叶片亚细胞超微结构TEM分析（G）。同一时间点不同字母表示CK、MT、ST和MST之间存在显著差异（p < 0.05）。

第7天的超微结构观察显示CK组严重退化。细胞膜破裂，细胞完整性丧失，叶绿体向内部迁移。双层膜外膜破裂，基质内容物泄漏，形成多个空腔。基粒类囊体堆叠松散，质体小球聚集。相比之下，MST组细胞膜不连续，部分叶绿体溶解但仍位于细胞壁附近。类囊体片层可见但结构不清，质体小球数量减少（图2G）。

**3.3 蛋白酶活性及自噬相关基因表达**

第7天，MT组和ST组的可溶性蛋白含量均显著高于CK组（图3A）。RuBisCO活性是叶绿体蛋白质功能的关键指标，在储存后期ST组显著高于其他各组（图3B）。值得注意的是，MST组的RuBisCO活性也显著高于CK组和MT组。相比之下，CK组在整个储存期间总蛋白酶活性持续升高，第7天显著高于所有处理组（图3C）。总体而言，这些结果表明各处理有效抑制了整体蛋白质降解。

 图3. 小白菜在20℃下储存7天期间的蛋白含量（A）、RuBisCO活性（B）、总蛋白酶活性（C）以及BrATG1A（D）、BrATG1B（E）、BrATG4A（F）、BrATG7（G）和BrNAC29（H）的相对表达量。数据以均值±标准差表示（n = 3）。同一时间点不同字母表示CK、MT、ST和MST之间存在显著差异（p < 0.05）。

RT-qPCR结果显示，CK组在储存后期多个BrATG基因的表达显著上调，而各处理均不同程度地抑制了这种上调。其中BrATG1A（图3D）、BrATG1B（图3E）、BrATG4A（图3F）和BrATG7（图3G）表现出最显著的表达变化。储存第一天，MST组BrATG7的表达水平显著高于其他各组。这种早期的暂时性升高可能代表了一种保护性自噬响应，与CK组在后期储存中观察到的持续上调不同。第5天，MT组的BrATG7表达水平最低。储存最后一天，对照组的BrATG7表达水平显著高于其他各组。三种处理组之间未检测到显著差异，各组均有效抑制了BrATG7的转录表达。

类似地，BrNAC29——一种被鉴定为BrATG7潜在上游调控因子的NAC家族转录因子——的表达在储存后期CK组中同样显著上调，而三种处理均抑制了其表达（图3H）。BrNAC29的表达模式与BrATG7高度相似，与其潜在的调控关系一致。

**3.4 BrATG7与品质指标的关联分析**

如图4所示，b值与SOD活性显著负相关（r = –0.95，p < 0.01），表明颜色变化与ROS代谢之间存在密切联系。叶绿素含量与BrPPH（r = –0.91，p < 0.01）表达量显著负相关，与RuBisCO活性（r = 0.89，p < 0.01）显著正相关，表明叶绿素降解与叶绿体拆解过程中叶绿体蛋白降解之间存在关联。

 图4. 小白菜在20℃下储存7天期间各代谢途径指标的关联分析。星号表示p < 0.05（*）和p < 0.01（**）水平的显著相关性。

在分析的BrATG基因中，BrATG7表现出最显著的时间动态表达变化，且与多个品质指标显著相关。BrATG7与SOD活性（r = –0.92，p < 0.01）、失重（r = 0.97，p < 0.05）、b值（r = 0.99，p < 0.01）以及BrCLH（r = 0.99，p < 0.01）、BrPPH（r = 0.98，p < 0.01）和BrNYC1（r = 0.99，p < 0.01）的表达量显著相关。此外，BrATG7还与叶绿素含量显著负相关（r = –0.81，p < 0.05）。值得注意的是，BrNAC29的表达量也与BrATG7表达量显著相关（r = 0.94，p < 0.01），支持二者之间存在潜在的调控相互作用（图4）。

**3.5 BrATG7的生物信息学分析**

在小白菜中总共鉴定出40个BrATG基因家族成员，其中BrATG7为单拷贝基因。通过克隆和测序获得的BrATG7序列与基因组参考序列并不完全相同。编码蛋白的预测等电点为5.03，表明其为酸性蛋白；不稳定指数为51.24，脂肪族指数为83.97，表明该蛋白相对不稳定。二级结构预测显示BrATG7蛋白由四种结构类型组成：α-螺旋（37.30%）、延伸链（15.21%）、β-转角（3.73%）和无规卷曲（43.76%）（图5A）。

 图5. BrATG7蛋白结构（A）及BrATGs启动子顺式调控元件的热图（B）。

启动子分析表明，BrATG7启动子含有光响应元件以及响应茉莉酸甲酯、赤霉素和脱落酸的元件，提示其可能参与胁迫响应和采后衰老过程。不同BrATG基因中顺式元件的分布见图5B和表S1。关于激素响应性，大多数BrATG家族成员含有MeJA响应元件，表明MeJA可能作为调控自噬途径的核心激素信号发挥作用。此外，大多数成员还含有响应赤霉素、脱落酸和水杨酸的元件，表明自噬受多种植物激素信号的协同调控。值得注意的是，所有BrATG成员均含有十个以上的光响应元件，突显了光作为调控自噬的重要环境因素。

**3.6 BrATG7的功能验证**

BrATG7在烟草（N. benthamiana）叶片和拟南芥原生质体中定位于细胞质（图6A及图S1）。BrATG7在小白菜和/或烟草中的过表达降低了RuBisCO活性（图6B及图S2）并促进了黄化（图6C），表明叶绿体中蛋白质的降解。

 图6. BrATG7在拟南芥原生质体中的亚细胞定位（A，比例尺10 μm）、空载体对照与BrATG7过表达小白菜叶片的RuBisCO活性比较（B，**表示差异显著，p < 0.01）、BrATG7瞬时过表达小白菜植株的表型（C）。

**3.7 BrNAC29调控BrATG7的表达**

既往研究表明，NAC转录因子调控自噬相关基因（如ATG8a、ATG8i和ATG9）的表达（Furuta等，2024；Wang等，2026b；Zeng等，2025b）。根据一项未发表研究的转录组数据，小白菜储存期间共有104个BrNAC被转录，具有多样的表达谱（图7A，表S5）；其中十七个上调且与BrATG7表现出极强的关联（变化倍数≥1.5且FDR < 0.05；相关系数≥0.8）（图S3）。结合PlantRegMap数据库关于BrATG7潜在上游调控因子的信息，只有BraA07g035620.4 C（BrNAC29）和BraA03g056490.4 C（BrNAC75）能与BrATG7启动子相互作用（图7B）。因此，随机选取BrNAC29进行进一步研究。根据PlantRegMap数据库，BrNAC29可能仅与BrATG7启动子中的一个顺式作用元件（核心基序：CACGTAAGT）相互作用，具体位于起始密码子相对位置的–1469至–1460处。

 图7. 储存期间各时间点未经处理BrNAC转录因子家族成员表达谱的热图，基于log?(FPKM + 1)值（A）。维恩图显示Group 1与Group 2的重叠部分：Group 1包含与BrATG7表达模式相似的BrNACs（Pearson相关系数≥0.8），Group 2包含预测可结合BrATG7启动子的BrNACs（B）。BrNAC29在烟草叶片中的亚细胞定位（C，比例尺20 μm）。BrNAC29与含有BrATG7启动子的报告基因共表达的LUC/REN比值（D）。结合位点示意图及ChIP-qPCR结果（E）。星号表示p < 0.05（*）和p < 0.01（**）水平的显著相关性。

如图7C所示，BrNAC29定位于烟草叶片细胞核中。在烟草叶片中，BrNAC29与含有BrATG7启动子的报告基因共转化后，LUC/REN比值与空载体对照相比提高了约两倍（图7D）。此外，ChIP-qPCR分析显示，与空载体对照相比，含有BrNAC29结合元件的BrATG7启动子片段存在显著富集（图7E）。

**4. 讨论**

**4.1 1-MCP和蔗糖通过不同但互补的机制延缓采后衰老**

包括乙烯、氧化胁迫和碳饥饿在内的多种信号驱动叶菜类蔬菜的采后衰老（Ferrante和Carillo，2025；Gan，2022）。本研究中发现，1-MCP和蔗糖处理均能有效延缓小白菜的品质劣化，但主要通过不同的作用方式。

尽管小白菜乙烯产量极低，但1-MCP已知可阻断乙烯感知（Able等，2005）。1-MCP处理在减少ROS积累方面的有效性表明，即使低水平的乙烯也可能对衰老相关的氧化胁迫有所贡献。

作为乙烯受体的竞争性抑制剂，1-MCP能够阻断乙烯感知及其下游信号传导，从而延缓衰老相关进程（Guo等，2026；Yu等，2024b）。在本研究中，1-MCP处理显著降低了呼吸速率（图1C），并抑制了叶绿素降解基因的表达（图2D、E、F）。已知乙烯可通过上调NADPH氧化酶和下调抗氧化酶来促进活性氧（ROS）的积累（Iqbal等，2023；Islam等，2021）。通过抑制乙烯作用，1-MCP可缓解氧化应激，这一结论在MT组相比CK组表现出更低的MDA含量和更低的O2•-生成速率中得到了印证（图1E、F）。这些发现与以往报告一致，即1-MCP能够维持采后叶菜类蔬菜的抗氧化能力（Hassan和Mahfouz，2012；Hu等，2021a；Song等，2020）。

蔗糖可缓解碳饥饿，并为应激反应提供能量。与土壤分离后，叶菜类蔬菜丧失了光合碳固定能力，内源糖分会被快速消耗（Mbong等，2017），由此导致的碳饥饿是强烈的自噬和衰老诱导因子（Kacprzak和Van Aken，2022；Mcloughlin等，2020）。外源蔗糖可提供替代碳源，维持基础代谢，延缓饥饿诱导的衰老（Asad等，2021；Di等，2022）。在本研究中，蔗糖处理（ST）维持了较高的可溶性蛋白含量和RuBisCO活性（图3A、B），并显著抑制了BrATG基因的上调（图3D–G）。此外，已有研究表明蔗糖可直接清除ROS（Guo等，2025；Zeng等，2023），这可能解释了ST组中氧化损伤降低的现象（图1E、F）。

1-MCP与蔗糖之间的协同作用源于它们同时靶向衰老过程中协同诱导自噬的两个相互关联的信号：ROS和碳饥饿（Zhang等，2023）。通过阻断乙烯感知，1-MCP抑制了ROS积累；而蔗糖则补充了能量状态，减弱了饥饿信号传导。MST组未表现出最低呼吸速率（图1C）这一现象，可用蔗糖作为替代碳源来解释，它在一定程度上抵消了1-MCP单独处理所导致的呼吸抑制。此外，蔗糖维持了抗氧化能力，强化了1-MCP对ROS的抑制作用（Cadena-Ramos等，2026；Sevgi和Leblebici，2025）。这种双重作用解释了为何MST在抑制BrATG7表达、维持叶绿体完整性和延缓叶片黄化方面均优于单独处理。

4.2 自噬的适时调控在采后衰老过程中保护RuBisCO和叶绿体完整性

诸如营养缺乏和黑暗等胁迫条件，是叶菜类蔬菜采后与土壤分离后所面临的主要挑战（Shezi等，2024；Spadafora等，2020）。在胁迫条件下，作为分解代谢过程的自噬可以降解受损细胞器并回收养分（Kacprzak和Van Aken，2022；Zhu等，2022）。然而，自噬在衰老过程中的作用是剂量和阶段依赖性的。基础水平的自噬对于清除氧化损伤蛋白质和功能障碍线粒体至关重要，从而防止ROS过度积累并维持细胞稳态（Barros等，2023a；Oikawa等，2022），而自噬流过度激活则会导致功能性蛋白质和细胞器的失控降解，加速衰老进程（Xing等，2024）。

在本研究中，BrATG7的表达动态表明，MST处理以时间上有利的方式调控了自噬。在贮藏第1天，MST组中BrATG7的转录水平显著高于MT、ST和CK组（图3G）。值得注意的是，这种早期短暂的升高可能处于有利于通过清除采收诱导的损伤来维持品质的范围内，这与CK组在后期贮藏中观察到的持续且过度上调形成对比。这种早期瞬时诱导很可能反映了维护性自噬反应，即清除因采收相关胁迫而受损的大分子和细胞器，从而在贮藏初期阶段限制ROS的扩散（Shinozaki等，2024）。第5天，MT组中BrATG7的表达最低；到第7天，MT和MST组的表达水平均显著低于CK组（图3G）。此外，CK组的总蛋白酶活性显著高于各处理组（图3C）。ST组的RuBisCO活性显著高于其他组（图3B），表明蔗糖处理有效地保护了这一关键光合酶。RuBisCO是衰老过程中自噬降解的主要靶标（Paluch-Lubawa等，2021；Wan等，2023）。在小白菜中的过表达实验表明，BrATG7过表达会降低RuBisCO活性，提示其在RuBisCO周转中具有保守的功能作用，但仍需在小白菜中进一步验证。因此，各处理组中BrATG7表达的精确调控很可能在允许有益的早期回收的同时，防止RuBisCO被包裹进含RuBisCO的小体并转运至液泡。这些观察表明，MST并非简单地组成性抑制自噬，而是允许有益的早期自噬反应发生，同时防止了会拆解RuBisCO等关键光合蛋白的持续性过度激活。

在叶片衰老过程中，自噬活性显著增强（Lee等，2024；Zhang等，2023），许多研究表明过度自噬会主动拆解叶绿体功能，从而加速叶片黄化和品质劣变（Dominguez和Cejudo，2021；James等，2025）。在本研究中，所有三种处理均抑制了多个BrATG基因的表达（图3D-G），MST组的叶绿体完整性优于CK组（图2G）。

此外，本研究中的关键基因BrATG7是ATG8依赖性微自噬的限速基因，它在自噬体形成过程中激活ATG8家族蛋白的C端甘氨酸残基以扩展自噬膜（Liu等，2025；Sun等，2023）。该通路最终导致基质蛋白（如RuBisCO）和类囊体膜的降解。在本研究中，CK组表现出较高的BrATG7表达（图3G），与之伴随的是严重的超微结构损伤，包括叶绿体包膜破裂、基粒类囊体排列紊乱以及质体球聚集（图2G）。这些特征属于叶绿体晚期降解的表现（Fu等，2025；Xie等，2022）。相比之下，由于避免了BrATG7的持续性上调，MST组在第7天表现出明显延缓的叶绿体降解进程。尽管与第0天相比可见一定程度的结构紊乱，但与CK组相比，MST组的结构保存更为完整：叶绿体包膜破裂频率较低，基质泄漏减少；尽管仍观察到部分不连续细胞膜和叶绿体裂解，但类囊体网络仍部分可辨。CK组中广泛存在的包膜破裂和基质泄漏现象在MST组中并未出现（图2G）。质体球是衰老过程中随类囊体膜拆解而积累的脂滴（Coulon等，2024），MST组中质体球数量减少表明降解程度较轻。

除了对叶绿体超微结构的影响外，自噬还影响叶绿素分解代谢和蛋白质周转（Lee等，2024）。拟南芥atg7突变体表现出叶绿素损失延迟，并在黑暗诱导的衰老中保留了较高水平的光合蛋白（Buchanan等，2005；Doelling等，2002）。这是因为叶绿素降解酶常与ATG基因表达相关联，且其活性依赖于叶绿体包膜的完整性（D'Inca等，2021；Hu等，2021b）。在本研究中，三种处理均显著抑制了BrCLH、BrPPH和BrNYC1的表达（图2D-F），且BrATG7的表达与这些叶绿素降解基因存在相关性。这表明自噬的抑制通过减少叶绿素分解间接维持了叶绿体结构（Barros等，2023b；Lee等，2024；Siegel等，2025）。

4.3 BrATG7作为连接上游胁迫信号与叶绿体蛋白降解的核心调控节点

ATG7作为类似E1的激活酶参与两个自噬体形成所需的类泛素共轭系统，即ATG12-ATG5共轭系统和ATG8-PE共轭系统（Minina等，2018；Ohsumi，2001；Zhuang等，2024）。缺乏ATG7时，自噬体生物发生受阻，这在拟南芥atg7突变体中得到了证实——该突变体无法形成自噬体，并在营养限制条件下表现出异常的衰老表型（Doelling等，2002；Hashimi等，2023；Yan等，2024）。由于ATG7催化ATG8和ATG12的激活，这是自噬体形成中两个必需且限速的步骤，其转录调控构成了胁迫诱导衰老的关键控制点。ATG7在各植物物种的叶片衰老过程中均持续上调（Wada等，2015；Zhu等，2022）。在拟南芥中，AtATG7的转录水平在黑暗诱导和自然衰老过程中急剧升高（Breeze等，2011）。在本研究中，CK组在贮藏后期BrATG7表达显著上调（图3G），与其在叶片衰老中已被确认的诱导模式一致。

此外，与野生型植物相比，拟南芥atg7突变体在黑暗诱导的衰老过程中保留了更高水平的RuBisCO蛋白，并表现出叶绿素损失延迟（Lee等，2013；Wijerathna-Yapa等，2021）。本研究表明，BrATG7在小白菜中的过表达导致RuBisCO活性相比野生型对照显著下降（图6B）。这一发现提供了直接证据，表明BrATG7的上调足以损害叶绿体蛋白功能，并与增强的自噬相关（Minina等，2018）。

相关性分析进一步将BrATG7定位为多条品质劣化通路的核心节点。BrATG7的表达与黄化指数b值（r=0.99，p<0.01）、失重（r=0.97，p<0.05）以及叶绿素降解基因的表达（所有r>0.98，p<0.01）均呈显著相关（图4）。重要的是，BrATG7的表达与SOD活性呈负相关（r=?0.92，p<0.01），与O2•-生成速率呈正相关，将BrATG7的上调与氧化应激联系起来，而氧化应激是自噬的关键诱导因子（Yue等，2021；Zhou等，2018）。这些相关性表明，BrATG7并非孤立发挥作用，而是整合了ROS积累、乙烯信号传导（被1-MCP抑制）和碳状态（被蔗糖缓解）等信号。因此，MST处理很可能是通过同时靶向这些上游诱导因子来抑制BrATG7的。

启动子分析为这些生理观察提供了分子基础。BrATG7启动子中存在ABA响应元件尤为值得关注，因为ABA水平通常在采后贮藏期间升高并诱导自噬（Anastasiadi等，2022；Zeng等，2022）。已有报告指出1-MCP可在某些植物中抑制ABA合成（Li等，2024a；Wang等，2019），而蔗糖可拮抗ABA信号传导（Danieli等，2023）。因此，MST处理可能通过降低ABA积累或敏感性来减少BrATG7的转录。这些可能性有待进一步研究。

一个涉及BrNAC29的潜在上游调控通路增加了另一层控制机制。荧光素酶互补实验证实BrNAC29特异性结合于BrATG7启动子（图7D）。NAC转录因子是已知的叶片衰老调控因子（Li等，2024b；Lu等，2025；Lu等，2024；Xiong等，2025），我们的发现表明BrNAC29可能在采后胁迫条件下直接激活BrATG7的转录。BrNAC29的表达在CK组中呈上调趋势，并受到各处理的抑制（图3H）。BrNAC29和BrATG7的转录表达之间存在显著相关性（r=0.94，p<0.01）。这一结果提示MST处理可通过抑制BrNAC29的转录来降低BrATG7的表达。

综上所述，BrATG7作为关键调控节点，整合了包括ROS、碳饥饿和乙烯在内的多种采后胁迫信号；当其被上调时，通过增强的自噬流加速叶绿体蛋白降解。1-MCP和蔗糖处理，尤其是二者联合使用时，抑制BrNAC29并影响BrATG7的表达，为采后保鲜提供了新的机制基础。

4.4 拟定的调控机制模型

综合以上发现，我们提出了小白菜采后品质劣变及其受1-MCP和蔗糖处理调控的统一模型（图8）。在采后贮藏期间，小白菜经历多种胁迫，包括黑暗、内源乙烯积累和碳饥饿。这些条件触发ROS积累并上调自噬相关基因，尤其是BrATG7。增强的自噬流随后加速叶绿体蛋白的降解。这一过程导致叶绿体拆解和功能丧失，最终引起叶片黄化和品质下降。

调控机制的模型假说。相比之下，三种处理（1-MCP、蔗糖及其联合处理）通过靶向自噬的上游诱导因子来延缓品质劣变。1-MCP抑制乙烯引发的活性氧（ROS）积累，而蔗糖则缓解碳饥饿。通过减轻这些胁迫，这些处理抑制了BrATG7的上调及其后续对叶绿体组分的自噬性降解，从而维持叶绿体完整性并保持采后品质。值得注意的是，这些处理还通过抑制BrNAC29（一种BrATG7的直接激活因子）的转录上调来增强这一保护作用。这种额外的抑制作用限制了BrATG7介导的叶绿体蛋白自噬性降解，尤其是RuBisCO的降解，从而为叶绿体功能的保存提供了更优越的效果。5. 结论在所测试的处理中，1-MCP与蔗糖联合处理（MST）最有效地延缓了小白菜的衰老，表现为叶片黄化减轻、ROS积累降低以及超氧化物歧化酶（SOD）活性增加。在机制层面，MST抑制了BrNAC29的上调——我们已证实该转录因子可直接结合并激活BrATG7启动子。因此，BrATG7的转录本水平降低。功能证据表明，BrATG7的过表达降低了RuBisCO活性，暗示该基因参与叶绿体蛋白降解过程。相关性分析进一步将BrATG7的表达与叶绿素分解代谢、氧化应激及品质下降联系起来。综合而言，这些发现确立了一条调控级联途径：MST减轻氧化胁迫和碳饥饿，从而抑制BrNAC29-BrATG7模块，限制叶绿体蛋白的过度自噬性降解，并维持叶绿体完整性。本研究将BrATG7确定为关键分子靶标，并为1-MCP与蔗糖在叶菜类蔬菜中的协同保鲜效应提供了机制基础。CRediT作者贡献声明王立彬：数据整理、写作—审阅与编辑、调查研究。蒋丽：写作—审阅与编辑、监督、项目管理、经费获取。冯利：资源、方法论、数据整理。张梦洁：写作—审阅与编辑、方法论、调查研究。韩佳媛：写作—审阅与编辑、写作—初稿撰写、调查研究、形式分析、数据整理。韩佳媛|张梦洁|冯利|王立彬|蒋丽