PCYT2通过Notch信号通路抑制鸡原代肝细胞中的脂质积累

《Poultry Science》：PCYT2 Inhibits Lipid Accumulation via the Notch Signaling Pathway in Chicken Primary Hepatocytes

　　

磷脂酰乙醇胺胞苷酰转移酶2（Phosphatidylethanolamine cytidylytransferase 2, PCYT2）是磷脂酰乙醇胺合成的关键酶，在脂质代谢中发挥重要作用。研究人员的前期研究显示，PCYT2在鸡肝脏中于胚胎第14天（E14）与出壳后第1天（D1）之间呈现差异表达。然而，其在鸡脂质代谢中的功能和调控机制仍不清楚。本研究利用鸡原代肝细胞，通过过表达和敲低实验探究PCYT2在脂质代谢中的作用，并利用转录组测序进一步分析其调控机制。结果表明，过表达PCYT2显著降低鸡原代肝细胞中的脂滴含量、甘油三酯（triglyceride, TG）和总胆固醇（total cholesterol, TC）水平。这些降低与脂肪生成相关基因和蛋白（ACC和FASN）的下调以及脂肪酸氧化相关基因和蛋白（CPT1、ACOX1和ACSL1）的上调有关。相反，敲低PCYT2则产生相反的调控效应。随后，转录组测序结果显示，过表达PCYT2显著抑制Notch信号通路的活性。使用Jagged-1激活Notch信号通路可显著减弱PCYT2过表达对鸡原代肝细胞脂质代谢的调控作用。具体而言，Notch激活增加了PCYT2过表达肝细胞中的脂质含量，上调了ACC和FASN的表达水平，并下调了CPT1、ACOX1和ACSL1的表达水平。总之，这些结果表明，PCYT2通过增强脂肪酸氧化和抑制脂肪生成来负调控鸡原代肝细胞中的脂质积累，而Notch信号通路是该过程的关键介导因子。这一发现为改善鸡肝脏脂质稳态和减少脂肪沉积提供了新的分子靶点。

在现代家禽业中，高强度遗传选育追求快速生长和高产肉量，但伴随出现了腹部脂肪过度沉积和脂肪肝综合征，损害饲料效率、胴体品质与鸡群健康。肝脏是鸡脂质代谢的中枢器官，其生理功能与全身脂肪沉积密切相关。值得注意的是，鸡胚发育后期，尤其是胚胎第14天（E14）至出壳后第1天（D1），肝脏脂质代谢发生剧烈重编程。由于胚胎发育决定出壳后的生产性能与健康状态，解析该阶段肝脏脂质代谢的关键分子调控因子，对开发减少脂肪沉积、维持脂质稳态的新策略至关重要。研究人员前期通过单核转录组测序筛选到PCYT2在E14与D1鸡肝脏中差异表达。磷脂酰乙醇胺胞苷酰转移酶2（PCYT2）是CDP-乙醇胺途径的限速酶，催化磷脂酰乙醇胺（PE）合成，而PE是主要膜磷脂，参与膜完整性、脂质转运和信号转导。哺乳动物研究已证实PCYT2在脂质稳态中的关键作用，但它在鸡肝脏脂质代谢中的功能与机制尚不清楚。因此，本研究旨在阐明PCYT2在鸡原代肝细胞脂质代谢中的作用及调控机制。该研究发表于《Poultry Science》。

研究人员从陕西咸阳大成禽业公司获取Arbor Acres肉鸡受精蛋，常规孵化后于E14和D1采集肝组织，分离培养鸡原代肝细胞。通过pcDNA3.1-PCYT2过表达质粒和靶向PCYT2的siRNA转染细胞，构建功能获得与缺失模型。利用油红O染色检测脂滴含量，试剂盒测定甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平；qPCR和Western blot检测脂质代谢相关基因与蛋白表达；对过表达PCYT2细胞进行转录组测序，以GRCg6a为参考基因组，鉴定差异表达基因（DEGs），进行KEGG富集和基因集富集分析（GSEA）；并采用Notch通路激活剂Jagged-1进行救援实验。

**PCYT2在E14和D1中的表达**
通过qPCR和Western blot检测E14鸡胚和D1雏鸡肝组织及原代肝细胞中PCYT2的mRNA和蛋白水平，发现D1组均显著高于E14组，证实PCYT2具有阶段特异性表达模式，并支持原代肝细胞作为后续功能研究的可靠模型。

**PCYT2敲低或过表达效率验证**
转染siPCYT2后，PCYT2的mRNA和蛋白水平显著降低；转染pcDNA3.1-PCYT2后则显著升高。CCK-8检测显示两种操作均不影响细胞活力，表明成功构建了可用于功能研究的细胞模型。

**PCYT2对脂质含量的影响**
油红O染色显示，敲低PCYT2显著增加脂滴含量，过表达则显著减少；生化检测进一步表明，敲低组TG和TC水平显著升高，过表达组则显著降低，证明PCYT2负调控鸡原代肝细胞的脂质积累。

**PCYT2对脂质代谢相关基因和蛋白表达的影响**
与对照组相比，敲低PCYT2显著上调脂肪生成基因乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合酶（FASN）的mRNA和蛋白水平，同时下调脂肪酸氧化相关基因肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1）、酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）和长链脂酰辅酶A合成酶1（ACSL1）的表达；过表达PCYT2则呈现相反趋势。这表明PCYT2通过抑制脂肪生成和促进脂肪酸氧化来调节脂质代谢。

**过表达PCYT2的转录组测序分析**
对pcDNA3.1和pcDNA3.1-PCYT2组细胞进行转录组测序，共鉴定到459个DEGs（82个上调、377个下调）。KEGG富集分析显示DEGs显著富集于Notch、MAPK、FOXO、PPAR信号通路及脂肪酸生物合成等通路；GSEA进一步确认Notch信号通路在PCYT2过表达组中显著下调。随机选取6个DEGs进行qPCR验证，结果与测序数据一致；Western blot显示过表达PCYT2显著降低NICD、Notch1和Hes1蛋白水平，敲低则相反，进一步证实PCYT2抑制Notch信号通路。

**PCYT2通过抑制Notch信号通路调控脂质代谢**
用Jagged-1激活Notch信号通路后，与单纯过表达PCYT2组相比，脂滴含量、TG和TC水平显著回升，ACC和FASN表达上调，CPT1、ACOX1和ACSL1表达下调，表明Notch激活减弱了PCYT2过表达对脂质代谢的调控作用，说明PCYT2至少部分通过抑制Notch信号通路发挥功能。

**讨论与结论**
讨论部分指出，PCYT2通过调节脂肪合成与氧化平衡来影响肝脏脂质代谢，与哺乳动物中观察到的表型一致。转录组分析还发现ACACB和ANGPTL4下调、FABP1上调，与脂质降低表型相符。Notch信号通路首次被鉴定为介导PCYT2调控家禽肝脂代谢的关键通路。综上所述，研究结果表明，PCYT2通过增强脂肪酸氧化和抑制脂肪生成来调节鸡原代