生物正交工程化益生菌-T细胞嵌合体通过空间DC-T细胞免疫许可增强过继细胞治疗

《Science Bulletin》：A bio-orthogonally engineered probiotic-T cell chimera amplifies adoptive cell therapy through spatial DC-T cell immune licensing

　　

过继细胞转移（ACT）在血液系统恶性肿瘤中已取得持久临床缓解，但在实体瘤中仍因T细胞浸润不良、持久性不足及肿瘤驱动的免疫抑制而受限。在此，研究人员报道了一种生物正交工程化的益生菌-T细胞嵌合体（T-FOLactis），其构建了一个相互增强的细胞-微生物系统：FOLactis（一种表达Flt3L-OX40L融合蛋白的工程化乳酸乳球菌）提供局部免疫刺激信号以增强T细胞活化和效应功能，而过继转移的T细胞则作为细胞毒性效应细胞和移动载体，促进细菌载荷向肿瘤微环境的递送。研究人员利用应变促进的叠氮-炔环加成化学，将FOLactis细菌共价锚定于T细胞表面，生成一种用于空间限制性免疫调节的细胞结合平台。在同系结直肠癌模型中，T-FOLactis较生理盐水处理的对照组将肿瘤负荷降低78.1%，较常规ACT降低65.0%，同时将中位生存期从22天延长至46天，且无明显全身毒性。机制上，T-FOLactis促进了树突状细胞（DC）-T细胞邻近，并建立了一个空间组织的免疫许可微环境，放大了FOLactis诱导的炎症信号（包括IL-18）的功能影响。这种空间配置与细胞因子可用性、DC成熟、局部共刺激和细胞毒性CD8⁺ T细胞效应编程的增强偶联相关。IL-18阻断损害了这一许可程序并降低了治疗获益，支持IL-18作为DC-T细胞许可微环境中的关键功能介质。总之，这些发现建立了一种模块化的细胞表面工程策略，通过协调的免疫网络参与来增强结直肠癌的过继细胞治疗。

论文解读：T-FOLactis：生物正交工程化益生菌-T细胞嵌合体增强实体瘤过继细胞治疗

实体瘤仍是全球癌症相关死亡的主要原因，尽管免疫检查点阻断等疗法取得进展，许多实体恶性肿瘤的治疗选择仍然有限，尤其是那些具有免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）和低免疫应答性的肿瘤。过继细胞转移（adoptive cell transfer, ACT）通过回输自体或工程化T细胞发挥抗肿瘤免疫作用，在血液系统恶性肿瘤中已取得显著疗效，但在实体瘤中常因肿瘤浸润不足、瘤内持久性差、免疫抑制性TME及T细胞进行性功能障碍而受限。为克服这些障碍，已有多种策略被探索，包括嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）工程、细胞因子装甲及材料介导的T细胞表面功能化等，但这些策略仍受制于靶向肿瘤外毒性、持久性有限或TME内空间协调不足。工程益生菌凭借其固有的肿瘤趋向性和局部递送免疫调节载荷的能力，成为有吸引力的免疫治疗手段。研究人员此前已报道，表达Flt3L-OX40L融合蛋白的工程化乳酸乳球菌（FOLactis）可通过在TME内提供树突状细胞（dendritic cell, DC）活化和局部共刺激信号来增强T细胞介导的肿瘤杀伤。基于此，研究人员假设将FOLactis共价整合至T细胞表面，可协同ACT的细胞毒性精确性与益生菌的肿瘤趋向性和免疫刺激能力，从而构建一种益生菌-T细胞嵌合体（T-FOLactis）。

为验证这一假设，研究人员利用生物正交化学将FOLactis共价锚定于T细胞表面。在同系结直肠癌模型中，T-FOLactis展现出优先的肿瘤靶向、持续的细胞毒性T细胞活性及持久的抗肿瘤应答，且无明显毒性。机制上，研究人员鉴定出白细胞介素-18（interleukin-18, IL-18）是该免疫许可程序的重要功能组分。该研究发表于《Science Bulletin》，建立了一种模块化的细胞表面工程框架，通过空间组织的免疫网络参与来增强实体瘤ACT。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：利用N-叠氮乙酰半乳糖胺四酰化（Ac4GalNAz）对T细胞进行代谢标记，引入叠氮基团；通过DBCO-PEG2k-NHS对FOLactis进行胺-NHS偶联修饰，引入二苯并环辛炔（DBCO）基团；利用应变促进的叠氮-炔环加成（strain-promoted azide-alkyne cycloaddition, SPAAC）将两种细胞共价偶联。研究使用同系CT26（BALB/c）和MC38（C57BL/6）结直肠癌模型，并采用CD45.1/45.2同系追踪模型评估T细胞迁移。通过流式细胞术、免疫荧光、活体成像、细菌菌落计数、单细胞RNA测序（scRNA-seq）及CellChat配体-受体分析等对免疫微环境和细胞间通讯进行表征。人原代T细胞购自STEMCELL Technologies，用于人源化体外验证。IL-18中和抗体实验用于验证IL-18的功能贡献。

研究结果如下：

**3.1 生物正交糖工程可实现FOLactis与T细胞的高效选择性偶联**：通过共聚焦显微镜、扫描电镜和流式细胞术，研究人员证实了FOLactis表面DBCO功能化和T细胞表面叠氮基团的有效引入。SPAAC反应后，59.7%的T细胞结合了Cy5标记的FOLactis，装载效率为62.5%，且偶联信号在72小时内可检测。该结果表明该化学方法可实现快速、高效、高选择性的细胞-细菌偶联。

**3.2 T-FOLactis协调T细胞活化和效应功能**：体外实验显示，与未修饰T细胞或T+FOLactis混合物相比，T-FOLactis显著上调CD4⁺和CD8⁺ T细胞的活化标志物CD69、CD25及CD137，降低CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）比例，增加CD8⁺ T细胞干扰素-γ（IFN-γ）产生，并提高肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）和IL-13的分泌。同时，T-FOLactis在多种效应细胞与靶细胞比例下均表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。

**3.3 T-FOLactis增强过继T细胞的肿瘤归巢和蓄积**：体外趋化实验显示T-FOLactis对肿瘤条件培养基和DC的趋化迁移率显著提高。体内活体成像和细菌回收实验表明，T-FOLactis增强肿瘤部位信号强度及持久性，肿瘤和肿瘤引流淋巴结（TDLN）中富集FOLactis，而主要器官和血液中极少检出。CD45.1/45.2同系追踪模型证实，T-FOLactis增加了供体CD45.1⁺ T细胞在脾脏和肿瘤中的比例。

**3.4 T-FOLactis在体内发挥持久抗肿瘤疗效**：在两个独立CT26同系模型中，T-FOLactis显著抑制肿瘤生长，与盐水对照组相比肿瘤负荷降低78.1%，与常规ACT相比降低65.0%，并将中位生存期从22天延长至46天。治疗期间未观察到体重显著下降、器官组织损伤或血清细胞因子显著升高，提示良好的体内安全性。

**3.5 T-FOLactis重塑免疫抑制性肿瘤微环境**：免疫荧光和流式细胞术显示，T-FOLactis增加肿瘤内CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润，CD8⁺ T细胞向CD44⁺CD62L^?效应记忆（Tem）表型分化，IFN-γ和颗粒酶B（GzmB）表达升高。TDLN和肿瘤内CD11c⁺ DC的CD80/CD86表达上调，肿瘤浸润自然杀伤（NK）细胞频率增加，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）呈现CD86升高、CD206降低的免疫刺激表型。

**3.6 T-FOLactis将FOLactis诱导的炎症信号与DC-T细胞许可空间偶联**：体外DC-T共培养显示T-FOLactis促进DC成熟和DC定向T细胞迁移，免疫荧光显示肿瘤内DC与CD8⁺ T细胞空间邻近。细胞因子谱分析显示T-FOLactis进一步提高IL-18和IL-23水平。体外IL-18中和显著抑制CD8⁺ T细胞的IFN-γ、GzmB和CD107a表达，而IL-23中和主要影响活化标志物和Treg比例。体内IL-18中和可加速肿瘤进展并缩短生存期，表明IL-18是DC-T细胞许可微环境中的关键功能介质。

**3.7 T-FOLactis诱导空间组织的DC-CD8⁺ T细胞通讯程序，且具有IL-18敏感成分**：scRNA-seq显示，T-FOLactis使瘤内CD8⁺ T细胞偏向效应和效应记忆状态，降低耗竭状态，细胞毒性评分升高；DC中Il12b、Il18、Cxcl9和Cxcl10等炎症程序上调。伪时间分析显示T-FOLactis将CD8⁺ T细胞推向终末效应状态，IL-18阻断则抑制这一转变。CellChat配体-受体分析表明，T-FOLactis增强DC-CD8⁺ T细胞双向通讯，包括MHC-TCR、Icam1、Cd86-Cd28、Ifng-Ifngr等相互作用，而IL-18中和削弱这些通讯。

**3.8 人T-FOLactis在人细胞系统中重现增强的免疫活性**：利用原代人T细胞构建人T-FOLactis后，同样观察到CD69、CD25、CD137表达升高，IFN-γ产生增加，并对人结直肠癌SW480和人胃癌AGS细胞显示出增强的细胞毒性，表明该平台的免疫增强特性可在人源细胞系统中重现。

讨论部分指出，T-FOLactis并非仅通过细胞因子诱导或直接替代现有ACT方式起作用，而是作为一种空间免疫放大器，将益生菌诱导的炎症信号转化为有效的DC-T细胞许可和细胞毒性T细胞编程。其主要优势在于通过生物正交偶联将转移T细胞与肿瘤适应性免疫刺激特性耦合，克服了实体瘤中空间协调不足的问题。同时，研究也承认其局限性，包括主要在鼠类同系模型中验证、临床转化需要GMP兼容的生产和质量控制标准，以及未来需要在人源化系统和患者来源模型中进一步评估。研究结论部分可翻译为：总之，研究人员开发了一种生物正交工程化的益生菌-T细胞嵌合体，通过改进肿瘤定位和空间组织的免疫许可来增强实体瘤过继细胞治疗。T-FOLactis并非仅通过细胞因子诱导起作用，而是空间协调FOLactis来源的炎症信号与DC-T细胞邻近、局部共刺激和细胞毒性CD8⁺ T细胞效应编程，其中IL-18是这一许可程序的关键贡献者。这项工作建立了一个工程化细胞结合免疫刺激微环境的通用平台，并为下一代益生菌-T细胞免疫疗法奠定了基础。