一种对亚硫酸盐和微环境粘度/极性具有双重响应的D-π-A共轭探针，用于神经细胞中铁死亡的成像

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A D-π-A conjugated probe with dual responses to bisulfite and microenvironmental viscosity/polarity for imaging ferroptosis in neural cells

　　

摘要

铁死亡是一种以脂质过氧化和细胞微环境变化（如黏度增加和极性降低）为特征的程式性细胞死亡形式。目前，能够同时对亚硫酸氢盐水平和微环境变化做出响应的荧光探针仍然较少。针对这一问题，我们设计并合成了一个具有D-π-A共轭结构的荧光探针。基于分子内电荷转移（ICT）机制，该探针对亚硫酸氢盐和微环境（黏度/极性）具有双重响应特性，并用于神经细胞的铁死亡成像。光谱研究表明，亚硫酸氢盐选择性地加成到探针的共轭双键上，阻断ICT过程，从而在绿荧光通道中引起显著的荧光增强。该探针具有较高的灵敏度和选择性，对HSO?^?的检出限低至0.31?μM。在微环境响应方面，随着黏度升高或极性降低，探针的荧光强度显著增强。进一步研究发现，在铁死亡过程中，细胞微环境的综合变化导致绿荧光和红荧光通道的荧光均增强。基于这种双通道同时响应特性，该探针已成功应用于神经元铁死亡的成像研究，能够有效区分铁死亡细胞与正常细胞。本研究为亚硫酸氢盐的检测和铁死亡微环境的动态可视化提供了一种简便有效的分子工具。

引言

在神经退行性疾病等中枢神经系统疾病中，铁死亡——一种新近发现的铁依赖性调控性细胞死亡形式——受到了广泛关注[1]，[2]，[3]，[4]。该过程由脂质过氧化驱动，其核心机制涉及活性氧物种的积累、活性硫物种的失调以及各种生物活性分子的动态调控，最终导致细胞膜的氧化损伤和硬化[5]，[6]，[7]，[8]。研究表明，铁死亡在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的病理进展中发挥关键作用，其异常激活可导致不可逆的神经元丢失[9]，[10]。在此过程中，细胞微环境发生显著变化，包括微黏度增加和极性改变等[11]，[12]，[13]，[14]。这些变化不仅伴随铁死亡发生，还进一步加剧氧化应激，形成加速神经元损伤的恶性循环。因此，铁死亡相关微环境参数的变化可作为神经系统疾病早期诊断的潜在生物标志物。

二氧化硫（SO?）及其衍生物（如亚硫酸氢盐，HSO?^?）是一类内源性气态信号分子，其稳态失衡与多种系统性疾病密切相关[15]，[16]，[17]。在正常生理条件下，体内SO?和HSO?^?水平受到严格调控以维持氧化还原稳态。然而，在铁死亡过程中，SO?/HSO?^?代谢显著紊乱，这与黏度和极性等微环境参数的动态变化内在相关[18]，[19]。这些因素协同作用，共同构成细胞氧化还原稳态的核心调控网络。因此，同步监测SO?/HSO?^?水平和微环境参数对于全面理解铁死亡的潜在机制至关重要。

铁死亡表现出高度的时空异质性，而依赖细胞裂解的传统分析方法无法实时监测活细胞中SO?/HSO?^?、黏度和极性等多个参数的动态变化。荧光探针技术凭借其高时空分辨率和非侵入性成像能力，为阐明这一复杂过程提供了有力工具[20]，[21]，[22]，[23]，[24]，[25]，[26]。然而，此前报道的大多数荧光探针仅限于单一响应功能——要么选择性检测HSO?^?，要么对黏度或极性变化敏感响应，能够同时集成多参数响应的探针相对较少。这种"单参数"检测策略难以揭示铁死亡过程中多个关键参数之间的交叉调控和动态相互作用，阻碍了对复杂调控网络的全面分析。因此，开发一种能够同时响应SO?/HSO?^?、黏度和极性的新型荧光探针，为铁死亡机制研究提供了新的技术工具，并拓展了荧光探针在多参数检测领域的应用。

基于上述考虑，我们通过吡啶修饰的三苯胺结构与吡啶乙腈之间的Knoevenagel缩合反应设计并合成了一种新型荧光探针。该探针能够同时响应三个参数：亚硫酸氢盐（HSO?^?）浓度、黏度和极性。响应机制如下：HSO?^?通过亲核加成特异性结合到探针分子中的不饱和双键上，阻断分子内电荷转移（ICT）过程，从而实现比率型荧光响应；同时，探针的荧光发射对黏度和极性变化具有敏感性。该探针已应用于BV2细胞和SH-SY5Y细胞铁死亡模型的荧光成像研究。此外，由于其具有细胞通透性、低细胞毒性和多参数响应特性，该探针还可用于评估调节铁死亡通路的潜在神经保护剂。

各章节摘要

实验所用试剂与仪器

本实验所用所有试剂均购后直接使用，无需进一步纯化。实验设备包括日立制造的荧光分光光度计（F-4700）和岛津制造的紫外可见分光光度计（UV-2600）。

TPA-VP的合成

首先，将中间体TPAPy-CHO（855?mg，2.0?mmol）与4-吡啶乙腈（284?mg，2.4?mmol）一起溶解于无水乙醇溶剂中。随后，加入哌啶作为催化剂。该

探针TPA-VP的设计

荧光探针的设计需要在光学性能优化与生物安全性要求之间取得平衡。三苯胺染料及其衍生物因其高荧光效率、易于功能化的分子结构和低细胞毒性而成为理想候选[27]，[28]，[29]。本研究通过Suzuki偶联反应将吡啶基团引入三苯胺骨架中，得到中间体TPAPy-CHO。该修饰策略不仅增强了

结论

总之，我们开发了一种多功能荧光探针TPA-VP，能够实现HSO?^?、黏度和极性的同时检测。该探针对HSO?^?具有高度选择性，检出限为0.31?μM，并已成功应用于BV2和SH-SY5Y细胞铁死亡模型的实时荧光成像研究。通过铁死亡抑制剂Fer-1的拮抗实验进一步验证了探针响应的特异性。综上，这些

作者贡献声明

张心月：探针合成、光谱实验和数据处理。商超：细胞实验和样品制备。杨芙蓉：协助探针合成。王蓉和李俊剑：概念构思、方法学建议、资金获取，以及手稿撰写、审阅和编辑。

利益冲突声明

作者声明，不存在已知可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢国家自然科学基金（82460695资助W.R.）的资金支持。

张心月|商超|杨芙蓉|王蓉|李俊剑

教育部热带生物资源重点实验室，海南大学药学院，中国海口