《Virologica Sinica》：A HiBiT-Tagged Influenza A Virus Reporter System Reveals Cytokine-Inhibitory Micropeptide 53 as a Modulator of Viral Infection and Immunopathology
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甲型流感病毒（IAV）持续威胁人与动物健康，亟需高效策略以鉴定宿主因子与抗病毒药物。报告病毒是上述工作的关键工具，但引入大片段报告基因常损害病毒适应度与遗传稳定性。研究人员将11氨基酸的HiBiT标签融合至A/WSN/1933（H1N1）骨架的非结构蛋白1（N
甲型流感病毒（IAV）持续威胁人与动物健康，亟需高效策略以鉴定宿主因子与抗病毒药物。报告病毒是上述工作的关键工具，但引入大片段报告基因常损害病毒适应度与遗传稳定性。研究人员将11氨基酸的HiBiT标签融合至A/WSN/1933（H1N1）骨架的非结构蛋白1（NS1）中，构建了复制胜任的报告型IAV。改性病毒保留了亲本病毒粒子形态、相近复制动力学及体内组织嗜性，同时实现高灵敏、快速、定量的病毒复制检测。基于该报告病毒，研究人员建立了具备优良 assay 质量的高通量筛选（HTS）平台，并验证其鉴定IAV感染宿主调节因子的能力。将该平台应用于宿主编码微肽（miPEP）筛查，鉴定出细胞因子抑制性微肽53（CIM53）这一新型IAV复制调节因子。机制上，CIM53通过内在抑制抗病毒先天免疫应答促进IAV复制。此外，尽管CIM53增强病毒复制，其免疫调节活性在与奥司他韦（OSV）联用时可降低感染小鼠肺损伤并改善存活。该研究建立了实用的病毒学筛选平台，并提示CIM53可作为重症IAV感染中宿主导向的辅助疗法候选。
研究背景方面，甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）属正黏病毒科人畜共患病原体，季节性流行由H1N1与H3N2亚型主导，而H5N1、H7N9等高致病性禽流感跨种传播风险持续存在。传统表达荧光蛋白或萤光素酶的重组IAV因基因组容量受限，常出现适应度下降与报告序列丢失；因此亟需超小标签以兼顾复制动力学与定量灵敏度。微肽（micropeptide, miPEP）作为由小开放阅读框翻译的短肽，在病毒-宿主互作中作用尚不明确。本研究发表于《Virologica Sinica》，研究人员旨在构建基于HiBiT（源自NanoLuc二元技术的11氨基酸分裂报告肽）的复制胜任报告病毒，并建立宿主因子筛选平台以发掘新型调节因子。
关键技术方法上，研究人员采用反向遗传学在A/WSN/1933（H1N1）骨架上将HiBiT插入NS1编码区内部，借助猪捷申病毒-1自切2A序列实现NS1-HiBiT与NEP/NS2共表达，并引入沉默突变消除NS1剪接；利用AlphaFold3进行同源建模；在MDCK、A549及Vero细胞中评估体外复制与遗传稳定性（传代P0–P4）；通过BALB/c小鼠（六周龄雌性）进行体内毒力与组织嗜性分析；以Nano-Glo系统检测相对发光单位（RLU），计算信噪比（S/N）、变异系数（CV）与Z′因子确立HTS质量；从SmProt数据库选取4条Ribo-seq验证的宿主miPEP（含SPROHSA49809/CIM53）在A549过表达筛选；并以poly(I:C)与干扰素-β（IFN-β）刺激解耦病毒载量干扰；体内疗效试验采用C57BL/6J小鼠（六周龄雌性）感染WSN后尾静脉给予PBS、OSV（30 mg/kg）、CIM53（50 μg/只）或联用方案。
研究结果部分，设计与生成HiBiT标记H1N1病毒小节显示，重组NS片段全长1222 bp，NS1-HiBiT经2A裂解有效，同源建模证实HiBiT暴露于NS1表面且不影响整体构象。体外表征小节中，核酸电泳、Western blot、免疫荧光与电镜证明WSN-NS-HiBiT保留80–120 nm病毒粒子形态、NS1/NEP定位及感染能力。生长动力学与遗传稳定性小节表明，MOI 0.01下24与48 hpi滴度略低于亲本，RLU于6 hpi可检、36 hpi达峰；P0–P3发光稳定，P4轻微下降但无HiBiT缺失，且WSN-NS-HiBiT感染诱导更高IFN-β与ISG（MxA、OASL、ISG15、OAS1、ISG56、IFITM3）表达。体内表征小节中，BALB/c小鼠鼻内105 TCID50感染显示WSN-NS-HiBiT体重下降不明显、零死亡，但在鼻甲与肺内复制滴度与亲本无差异，脑/脾/肾无毒，H&E与IHC显示呼吸道上皮NP抗原阳性，HI抗体滴度80–160，证实嗜性保留而毒力减弱。HTS平台建立与验证小节给出S/N 406024、CV 9.3%、Z′ 0.77；金刚烷胺剂量依赖抑RLU；CRM1过表达升RLU与NP拷贝数，TRIM25过表达降之，印证平台可筛药与宿主因子。miPEP筛选小节中，CIM53与164929促复制（RLU与qPCR一致），169103与159107抑复制。CIM53固有免疫抑制属性小节显示，在WSN感染背景下CIM53促NP mRNA且伴IFN-β/IL-1β等轻度上调；但在无病毒的poly(I:C)或IFN-β刺激下，CIM53显著压制上述基因；Vero（IFN-I缺陷）中CIM53不影响PR8复制，说明其促病毒效应依赖完整IFN-I通路。CIM53联合OSV小节中，C57BL/6J感染模型下OSV单药降病毒RNA但未改善生存，CIM53单剂升病毒RNA却减肺损伤，OSV+CIM53组8 dpi起体重部分恢复、生存40%，肺组织炎症浸润减轻，证实“抗病毒+免疫调节”互补。
讨论部分总结指出，相较N端融合NEP的H3N2-HiBiT，本研究内部插入NS1设计避免了末端包装信号破坏，但NS1-HiBiT对IFN-I拮抗部分受损解释了小鼠毒力下降；HiBiT需LgBiT互补故不适用于全身活体成像，定位为优质体外定量HTS而非体内示踪。CIM53由IFIT5的5′UTR编码，其双重性（促复制/抑炎症）反映病毒PAMP与宿主免疫间的动态平衡；体内证据支持重症流感需同时压制病毒载量与细胞因子风暴，宿主导向治疗（host-directed therapy）联用OSV具转化价值。
结论部分翻译如下：综上，研究人员开发并验证了复制胜任的HiBiT标记WSN报告病毒，可在大体保留亲本复制特征、组织嗜性与免疫原性下快速定量IAV复制。该HiBiT平台为监测感染及筛选抗病毒化合物与宿主调节因子提供稳健可扩展途径。应用此平台鉴定出CIM53这一免疫调节宿主因子，其促病毒效应关联于抑制抗病毒先天免疫。体内实验中CIM53在增加病毒负荷同时减轻IAV诱导肺损伤，与有效限毒的OSV联用可改善感染小鼠存活。上述发现确立HiBiT报告系统为IAV研究实用平台，并展现其发掘具互补治疗活性宿主调节因子的潜力。
