转录组筛选鉴定circRNA-INSR为禽流感病毒复制的新型宿主因子

《Virology》：Transcriptome screening identifies circRNA-INSR as a novel host factor associated with avian influenza virus replication

　　

摘要

环状RNA（circRNAs）是一类共价闭合的非编码RNA分子，在宿主与病原体相互作用中发挥重要的调控作用。禽流感病毒（AIV）H9N2亚型是一种在全球范围内广泛传播的病原体，给家禽养殖业造成巨大的经济损失，并具有跨物种传播给人类的风险。尽管越来越多的证据表明非编码RNA可以调控流感病毒的复制，但禽流感来源的circRNAs在H9N2 AIV感染过程中的表达模式和功能仍不清楚。本研究利用高通量RNA测序技术，系统研究了H9N2 AIV感染DF1细胞中circRNAs的表达动态。共鉴定出139个差异表达的circRNAs，其中58个上调，81个下调。值得注意的是，源自胰岛素受体（INSR）基因第2外显子的circRNA在病毒感染期间呈现持续上调。功能实验验证了其在H9N2 AIV复制中的促进作用。具体而言，siRNA介导的circ-INSR敲低显著抑制了H9N2 AIV的复制。本研究首次鉴定出circ-INSR作为一种促进流感病毒复制的宿主因子。我们的结果为开发基于circRNA的H9N2禽流感病毒防控策略提供了基础。

引言

环状RNA（circRNAs）是长链非编码RNA的一个独特亚类，具有共价闭合的环状结构，由前体信使RNA的非典型反向剪接事件产生（Memczak等人，2013）。过去十年中，借助新一代测序技术（NGS），数千种circRNAs被鉴定，并发现其广泛表达于多种物种中，包括果蝇、小鼠、猴子及人类。进一步的功能研究揭示，circRNAs可调控多种生物学过程，包括细胞增殖（Zhou等人，2025）、程序性细胞死亡（Chen等人，2023b）以及谱系特异性细胞分化（Liu等人，2022）。值得注意的是，哺乳动物和禽类细胞中circRNAs的丰度低于线性mRNA。这一差异主要归因于反向剪接效率远低于经典剪接（Zhang等人，2016）。circRNAs的表达模式在病毒感染时可发生动态改变，因为病毒可以劫持或调控宿主RNA加工机制以促进自身复制。例如，在单纯疱疹病毒感染期间有316个circRNAs显著上调，表明circRNAs可能在DNA病毒感染应答中发挥作用（Dremel等人，2024）。同样，RNA病毒感染也被证明可诱导宿主circRNAs的差异表达，如日本脑炎病毒（JEV）感染小鼠脑组织中的情况（Chen等人，2023a）。尽管已有上述观察，病毒感染如何调控宿主circRNAs反向剪接效率的分子机制尚未完全阐明。

环状RNA独特的共价闭合结构赋予其高度的稳定性和多样的调控能力，其中研究最为透彻的功能是其作为microRNA（miRNA）的"分子海绵"作用。circRNAs可通过隔离miRNA来解除miRNA靶标mRNA的翻译活性抑制，从而调控下游基因表达（Hansen等人，2013）。近年来，越来越多的证据凸显了circRNAs在调控病毒复制周期中的核心作用。例如，Li及其同事证明hsa-circ-0007321通过海绵吸附miR-492来调控登革热病毒（ZIKV）复制，进而激活核因子κB（NF-κB）信号通路（Kang等人，2023）。在甲型流感病毒（IAV）感染的背景下，circRNAs已被证明可与病毒蛋白直接相互作用。具体而言，circVAMP3可结合甲型流感病毒核蛋白（NP）和非结构蛋白1（NS1），从而限制病毒复制（Min等人，2023）。这些发现共同表明，circRNAs是宿主因子，其既可以促进也可以抑制病毒复制，具体取决于病毒与circRNA之间特定的相互作用。

在我们之前的研究中，我们聚焦于circRNAs在H1N1 IAV感染中的作用。通过全局circRNA谱分析，我们鉴定出circMYO9A作为宿主circRNA，通过减弱凝集素切割来调控H1N1的复制（Zheng等人，2025）。虽然已有研究记录了人类流感病毒亚型感染期间宿主circRNAs的失调（Chen等人，2022），但在H9N2 AIV感染过程中禽类来源的circRNAs图谱及其功能角色仍很大程度上未被探索。作为全球广泛流行的禽流感病毒亚型，H9N2 AIV因产蛋量下降和高死亡率给家禽养殖业造成巨大的经济损失。此外，H9N2病毒携带的内部基因可与其他亚型发生重配，产生具有增强人类致病性的新型人畜共患株，构成潜在的公共卫生威胁（Liu等人，2013）。

在本研究中，我们系统分析了H9N2 AIV感染的鸡胚成纤维细胞中禽类来源circRNAs的表达。通过这一方法，我们鉴定出circ-INSR——一种源自INSR基因的新型环状RNA——作为H9N2 AIV复制的关键调控因子。通过siRNA介导的circ-INSR敲低进行功能验证，结果显示H9N2病毒RNA拷贝数和病毒滴度均显著降低。此外，竞争性内源RNA（ceRNA）网络的构建揭示宿主细胞中存在复杂的circRNA介导的调控网络。总体而言，这些发现不仅加深了我们对circRNA介导的AIV感染调控的理解，也为开发针对H9N2 AIV的新型抗病毒策略提供了潜在靶点。

章节摘要

细胞与病毒

A549细胞和Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞在含10%胎牛血清（FBS）（Gibco）的DMEM培养基（Gibco）中，于37°C、5% CO₂条件下培养。鸡成纤维细胞系（DF1细胞）和鼠肺上皮细胞系（MLE-12细胞）在含10%胎牛血清（Sbjbio，中国）的DMEM培养基（Gibco）中，于37°C、5% CO₂条件下培养。A/chicken/Anhui/LH99/2017（H9N2）禽流感病毒在无菌（SPF）鸡胚中分离和传代。

病毒感染

将DF1细胞接种于12孔板中并用H9N2进行感染

circRNA测序工作流程

为系统表征禽流感病毒感染期间禽类来源circRNAs的表达动态及其功能参与，我们建立了H9N2禽流感病毒感染的DF1细胞（鸡胚成纤维细胞，禽流感病毒研究的标准模型）体外感染模型。实验工作流程如图1A所示。免疫荧光显微镜检查确认了病毒核蛋白的强健表达，证实

讨论

流感病毒因其跨越物种屏障感染人类的能力，对全球公共卫生安全构成重大挑战。由于禽类是IAV的主要储存宿主，理解流感病毒与禽类宿主细胞之间的分子相互作用对于开发抗病毒策略至关重要。宿主细胞因子，包括蛋白质编码基因和非编码RNA，在促进病毒入侵和复制过程中

结论

本研究描绘了禽流感病毒感染期间circRNA表达谱的动态景观。值得注意的是，我们鉴定出一种禽类来源的环状RNA circ-INSR，其与AIV感染具有显著关联。令人感兴趣的是，circ-INSR在多个物种中表现出进化保守性，并且在禽流感病毒感染期间显著上调。总体而言，这些发现为宿主来源的

CRediT作者贡献声明

邓露露：软件、方法学。曾怡然：方法学、调查研究。田宇森：软件、方法学。刘志源：初稿撰写、可视化、验证。郑怡青：方法学、调查研究。范梦璐：软件、方法学。萍继辉：监督、调查研究、资金获取、概念构思。苏娟：监督、调查研究、资金获取、概念构思

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

数据可用性

本研究中的所有数据均可应合理请求向通讯作者获取。

资助

本工作得到国家自然科学基金（资助编号：32473013、32272992和31772775；J.P.）以及宁夏回族自治区重点研发计划（资助编号：2026BBF02003）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

刘志源|范梦璐|郑怡青|曾怡然|邓露露|田宇森|苏娟|萍继辉

江苏省动物免疫学工程实验室 & 动物健康与食品安全教育部国际联合实验室，南京农业大学兽医学院，南京，210095，中国