利用玫瑰考克氏菌（Kocuria rosea）来源的IAA环保增强马铃薯微繁殖

《Scientific Reports》：Eco-friendly enhancement of potato micropropagation using bacterial-derived IAA from Kocuria rosea

　　

吲哚-3-乙酸（IAA）是一种由土壤细菌广泛合成的关键植物激素，在根系发育和胁迫耐受中具有重要作用。本研究旨在优化玫瑰考克氏菌（Kocuria rosea）SS1产生IAA的培养条件，并评估细菌来源IAA对马铃薯（Solanum tuberosum L. cv. Spunta）微繁殖的效果。在营养肉汤培养基中补充1 mM色氨酸，于pH 7、30 °C、振荡培养3天时，IAA产量最高（10.83 mg 100 mL^?1，经高效液相色谱（HPLC）定量）。将过滤灭菌的含IAA（0.0–1.0 mg L^?1）细菌上清液加入Murashige and Skoog（MS）培养基，并与商业IAA在马铃薯组织培养中进行比较。28天后，经细菌IAA处理的植株，特别是0.25 mg L^?1处理，与对照相比鲜重显著增加1.5倍、根数增加69.9%、叶片数增加100%、茎长增加50%，优于等剂量的合成IAA。生化分析显示总糖、叶绿素、类胡萝卜素、内源IAA和赤霉素水平升高。这些发现表明，细菌上清液是一种有效的环保生物刺激素，可增强体外繁殖马铃薯植株的生长和生化品质，为合成生长调节剂提供可持续替代方案。

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是继小麦、水稻、玉米之后的重要粮食作物，但以种薯进行无性繁殖易导致病毒、细菌、真菌和线虫等病原的累积与传播，仅病毒侵染就可造成高达75%的产量损失。植物组织培养和微繁殖技术可在无菌条件下快速繁殖无病植株，但培养基中通常需要添加植物生长调节剂（PGRs）。合成PGRs成本较高且存在环境负担，因此开发可持续、环保的替代物具有重要意义。土壤细菌可合成吲哚-3-乙酸（IAA）等植物激素，细菌来源IAA有望作为生物刺激素用于组织培养。为此，研究人员以玫瑰考克氏菌（Kocuria rosea）SS1为材料，优化其产IAA的培养条件，并评估细菌来源IAA对马铃薯品种Spunta微繁殖的影响，与商业IAA进行比较。

研究人员采用单因素逐一优化（OFAT）法，考察不同碳源、氮源、L-色氨酸浓度、培养时间、温度、初始pH及振荡/静置条件对菌株生物量干重和IAA产量的影响；以Salkowski试剂比色法定量吲哚，并用HPLC对优化后的IAA进行精确测定。将过滤灭菌的含IAA细菌上清液按0、0.10、0.25、0.50、1.00 mg L^?1加入MS培养基，与同浓度商业IAA对照；培养28天后测定植株形态与生化指标。结果表明，优化条件下最高IAA产量为10.83 mg/100 mL；0.25 mg L^?1细菌IAA使植株鲜重增加1.5倍、根数增加69.9%、叶数增加100%、茎长增加50%，均优于等剂量合成IAA。生化分析显示总糖、叶绿素、类胡萝卜素、内源IAA和赤霉素水平升高。该研究发表于《Scientific Reports》。

关键方法：研究人员从埃及吉萨省植物根际分离获得Kocuria rosea SS1（GenBank登录号OR944054），以营养肉汤为基础培养基进行OFAT优化；采用Salkowski比色法和HPLC定量IAA；以MS培养基进行马铃薯微繁殖，设置细菌上清液和商业IAA两组浓度梯度；形态指标包括鲜重、根数、叶数、茎长、根长；生化指标包括总糖（3,5-二硝基水杨酸 DNSA法）、总酚（Folin-Ciocalteu法）、总氨基酸（茚三酮法）、IAA和赤霉素（GA₃）含量、叶绿素和类胡萝卜素（分光光度法）；采用单因素和双因素方差分析及Tukey HSD检验。马铃薯品种为Spunta脱毒种薯，来自埃及艾因夏姆斯大学农学院草莓中心。

研究结果：

（1）培养条件优化。通过在营养肉汤中分别添加不同碳源，发现不额外添加碳源时Kocuria rosea SS1的IAA产量最高，为6.39 mg/100 mL，乳糖次之；葡萄糖和蔗糖主要促进生物量增加。氮源方面，有机氮源（牛肉膏、蛋白胨）比无机氮源更有利于IAA产生，营养肉汤原有成分组合效果最佳。振荡培养可使生物量增加约1–4倍，IAA产量提高约9倍。温度从25 °C升至30 °C时IAA产量显著增加，30 °C为最适温度，继续升温则产量急剧下降。初始pH 7最有利于IAA合成。L-色氨酸浓度在1.00 mM以内具有刺激作用，更高浓度无显著额外效果，且对生物量影响不显著。

（2）IAA产量时间进程与HPLC定量。在30 °C、150 rpm振荡、含1 mM L-色氨酸的营养肉汤中，指数生长期持续约28 h，IAA在对数生长后期开始积累，72 h达到最大值8.99 mg/100 mL。生物量与培养时间呈正相关（R²=0.9501），IAA产量与发酵时间也呈正相关（R²=0.9140）。在最优条件下培养后，HPLC测得IAA浓度为10.83 mg/100 mL，上清液被用作马铃薯微繁殖的天然IAA来源。

（3）IAA上清液或商业IAA对生长参数的影响。与商业IAA相比，含IAA细菌上清液在植株鲜重、根数、叶数和根长方面总体效果更优；两者对茎长的影响差异不显著。与未添加IAA的对照相比，各浓度IAA处理均促进马铃薯植株生长，其中0.25 mg L^?1细菌上清液处理效果最佳，使鲜重提高1.5倍、根数增加69.9%、叶数增加100%、茎长增加50%。对照植株的鲜重、根数和根长均为最低。

（4）IAA上清液或商业IAA对生化参数的影响。商业IAA在总氨基酸、IAA含量、GA₃含量和总叶绿素方面高于天然IAA处理；但两种IAA均能提高总糖、IAA、GA₃、总叶绿素和类胡萝卜素含量。0.1 mg L^?1商业IAA处理得到最高总氨基酸（19.76 mg/g鲜重）和IAA含量（0.72 mg/g鲜重）；1 mg L^?1天然IAA处理得到最低可溶性酚含量（6.51 mg/g鲜重）；0.25 mg L^?1天然IAA处理得到最低总氨基酸（7.56 mg/g鲜重）；0.1 mg L^?1天然IAA处理得到最高总糖。

讨论部分：IAA产量受培养基组分和环境因素显著影响，振荡条件通过改善氧传递和培养基均一性，促进色氨酸向IAA的酶转化。细菌培养滤液并非单纯的IAA溶液，而是含有铁载体、氨基酸、维生素、有机酸、胞外多糖、脂肽、挥发性有机物和抗氧化代谢物等的复杂生物化学基质，多种代谢物协同作用可能是其促生效果优于纯化IAA的原因。IAA可促进叶绿体发育和光合作用，增加碳水化合物生成；IAA-氨基酸结合物参与调节游离氨基酸库，因此处理植株游离氨基酸下降反映氮代谢和整体代谢活动增强。

研究结论：体外条件下，Kocuria rosea SS1（OR944054）在营养肉汤培养基、pH 7、30 °C、1 mM色氨酸、振荡培养3天时获得最高IAA产量（10.83 mg/100 mL）。利用组织培养技术，以0.25 mg L^?1浓度培养上清液形式供应的细菌来源IAA在MS培养基中对马铃薯植株的所有生长参数产生最大改善。这些发现凸显了细菌来源IAA作为可持续农业实践关键组成部分的潜力。产IAA细菌可通过增强水分和养分吸收促进植物生长，特别在不利环境条件下更为明显。其产生IAA的能力为生物施肥和生物刺激提供了有前景的机会，在提高植物对非生物胁迫抵抗力的同时，提供了一种环境友好的化学肥料替代方案。此外，将细菌培养滤液整合到植物组织培养方案中，代表了一种可持续作物繁殖的有前景的生物技术策略。未来研究应集中于阐明其促生长效应的机制、表征细菌培养滤液中完整的生物活性代谢物谱，并评估其在温室和大田条件下的效果。