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精密发酵（Precision Fermentation, PF）能够以工业规模生产单一、表征良好的重组蛋白，例如乳蛋白和卵清蛋白，且已有若干产品进入市场。许多PF来源的蛋白质，包括卵类粘蛋白和β-乳球蛋白，是已知的过敏原，其设计旨在成为天然同源物的精确结构拷贝
精密发酵（Precision Fermentation, PF）能够以工业规模生产单一、表征良好的重组蛋白，例如乳蛋白和卵清蛋白，且已有若干产品进入市场。许多PF来源的蛋白质，包括卵类粘蛋白和β-乳球蛋白，是已知的过敏原，其设计旨在成为天然同源物的精确结构拷贝；因此，评估侧重于等效性而非新危害。因此，当前的层级化方案，即过敏原数据库比对、消化率测试和血清免疫球蛋白E（IgE）结合试验，仍然适用。然而，残留的宿主细胞蛋白（host cell proteins, HCPs）、依赖于宿主的酶促糖基化改变以及工艺相关的杂质使得PF来源的产品并非完美的复制品；此外，热处理和高压处理、酶解以及非酶促糖基化可以修饰线性或构象表位，从而降低IgE结合或产生新表位（neoepitopes）。由于这些效应取决于生产过程中获得的结构属性，包括折叠稳定性、二硫键、糖基化和抗蛋白酶水解能力，PF来源的蛋白质与天然蛋白质可能对相同的加工处理产生不同响应。本综述探讨了PF生产各阶段获得的分子属性以及加工过程中产生的表位变化，重新评估了当前的评估方案，并为反映真实加工和消费条件的上市前安全框架概述了考量因素。
1. 引言
全球人口增长和饮食结构变化推动了对蛋白质的需求，但畜牧业面临温室气体排放及土地水资源限制等结构性制约。精密发酵（PF）作为一种替代方案，利用基因工程微生物直接生产特定动物蛋白，与传统发酵和生物质发酵有本质区别。截至2026年9月1日，美国食品药品监督管理局（FDA）已对十一项基于一般公认安全（GRAS）通知计划提交的重组牛奶或鸡蛋蛋白产品发出“无疑问函”。随着PF来源蛋白进入食品供应链，建立其安全性十分必要，尤其是针对作为主要过敏原的牛奶和鸡蛋蛋白。对于此类产品，关键问题不在于蛋白质是否引发过敏，而在于重组产品是否与其天然同源物行为一致。这种等效性并非不言而喻，因为宿主依赖的翻译后修饰（PTMs）、信号肽不完全切割导致的N端异质性以及纯化后残留的宿主衍生物质都会使最终产品与天然蛋白存在细微差异。此外，PF来源蛋白并非以纯化形式被食用，而是作为功能性配料用于乳制品和蛋清的替代品，因此会经历加工处理。食品加工可改变蛋白质的致敏性，其方向并不统一，可能因破坏表位而降低免疫球蛋白E（IgE）反应性，或因暴露隐藏表位或形成新表位而增加反应性。关键在于，调控这些加工响应的属性——三级结构稳定性、二硫键、糖基化和抗蛋白酶水解能力——正是在生产过程中建立的。因此，PF来源蛋白在相同加工条件下可能与天然对应物表现不同，其致敏性不仅由目标序列决定，还受整个生产和加工历史的影响。加工本身并非PF来源蛋白所独有，但进入加工的底物和发生加工的基质不同。目前针对转基因生物（GMO）食品中新表达蛋白建立的致敏性评估框架遵循层级化结构，但该框架是为检测未知致敏性蛋白的危害而设计的，而PF来源蛋白则是对已知过敏原的复制，同时承载着来自生产和加工的双重不确定性，因此其直接适用性需要单独考量。本综述聚焦于作为主要商业目标且本身即为管制过敏原的重组牛奶和鸡蛋蛋白，旨在描述PF生产各阶段获得的分子属性及其与天然同源物的偏差；考察热处理、高压加工（HPP）、酶解和糖基化如何修饰IgE结合表位及其对PF来源蛋白的潜在影响；并重新审视当前评估框架的每一层级，确定当评估中心从识别未知危害转向验证与已知过敏原的等效性时，每个层级所能确立的内容。
2. PF来源蛋白的生产
PF来源蛋白的生产涵盖上游和下游加工，从宿主选择到最终制剂。上游加工包括宿主选择、遗传设计与表达工程、发酵优化与放大；下游加工则回收和纯化表达的蛋白并将其转化为产品形式。每个阶段的选择不仅决定产量和纯度，也决定了与致敏性评估相关的分子属性，包括宿主依赖的PTMs、残留宿主细胞蛋白（HCPs）和工艺相关杂质。
2.1 表达宿主的选择
宿主选择是PF过程的起点，也是决定最终蛋白性质的关键决定因素。细菌平台如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌产量高、成本低，但缺乏真核糖基化机制，会产生非糖基化蛋白，且内毒素残留是革兰氏阴性宿主的一个问题。酵母平台因其PTM能力和安全使用历史而成为食品蛋白生产的主要宿主，例如具有GRAS状态的酿酒酵母和广泛用于生产β-乳球蛋白和卵清蛋白的毕赤酵母。丝状真菌如里氏木霉和黑曲霉能高效分泌蛋白，但保留了产生霉菌毒素的能力。宿主选择与致敏性的主要关联在于PTMs，特别是糖基化，会随宿主而变化。酵母N-聚糖为高甘露糖型而非哺乳动物中的复杂型，这种差异原则上可能改变IgE结合或产生新表位。宿主还决定了可能残留在最终产品中的杂质和危害，如残留HCPs、宿主来源多糖、内毒素和霉菌毒素。因此，宿主选择通过两条不同途径作用于致敏性：产品中宿主来源物质的直接存在，以及宿主在目标蛋白本身的分子属性上留下的印记。
2.2 遗传设计与表达工程
遗传设计涉及将密码子优化的目标基因与启动子、分泌信号和终止子结合。这些设计选择直接影响致敏性，因为它们定义了最终蛋白的一级结构。总体目标是获得与天然同源物完全一致的序列，但偏差可能出现。例如，在毕赤酵母中分泌的牛β-乳球蛋白，其α-交配因子前导肽的Glu-Ala间隔重复序列可能仍附着在成熟蛋白上，导致N端异质性。类似的异质性也在毕赤酵母中表达的鸡卵清蛋白中被报道。为提高功能性而引入的变体会改变序列本身，而宿主蛋白酶在分泌过程中的部分水解也会产生片段化形式。这些偏差与致敏性相关，例如β-乳球蛋白的N端区域位于携带顺序性IgE结合表位的分子部分。任何此类偏差原则上都可能产生新表位。
2.3 发酵优化与放大
培养条件通过培养基组成和过程控制来决定生产力。培养与致敏性的关系并非通过特定的分子机制，而是通过产品质量的一致性。在大规模生物反应器中，氧气、pH和底物浓度的空间梯度会施加局部压力并产生群体异质性，这是实验室规模所不具备的。两个后果与致敏性相关的属性有关：氧限制和pH波动会改变分泌途径的通量，导致同一菌株不同批次间聚糖加工的程度和均匀性可能发生变化；液泡蛋白酶在培养过程中积累，其水平随培养pH和碳源变化，分泌的产品会暴露于蛋白酶水解作用，从而修剪末端并产生片段化的蛋白形式。培养基成分本身也与致敏性相关。复杂的营养物质如蛋白胨是动物蛋白的酶解产物，欧洲食品安全局（EFSA）指南将其列为需考虑的因素。PF来源蛋白不能援引豁免权，因为它们是最终食品的组成部分而非加工助剂。
2.4 下游加工与产品制剂
下游加工从培养液中回收并纯化目标蛋白，并将其转化为最终制剂。色谱法提供最高纯度，但大宗食品蛋白需要替代的下游方法，膜分离和选择性沉淀是食品规模下的实用替代方案。PF来源的食品蛋白因此比相同序列的药物蛋白携带更多的残留宿主衍生材料。下游加工和制剂中的物理化学处理也可能改变目标蛋白自身的结构。pH调节、沉淀和干燥过程中的化学应激会改变天然结构和折叠。因此，下游加工决定了残留的杂质背景并修饰了结构，只有将杂质谱和结构在最终的制剂状态下一起分析，才能完全捕捉产品的致敏性。
3. 加工诱导的食品蛋白质致敏性变化
食品加工通过修饰IgE结合表位来改变致敏性。热和非热处理通过变性、聚集和水解破坏线性和构象表位，或通过共价修饰暴露隐藏表位和形成新表位。这些反应受折叠稳定性、二硫键、糖基化和抗蛋白酶水解能力控制，这些也正是决定致敏性本身的属性。PF来源蛋白作为功能性配料用于乳制品和蛋清替代品，会经历加热、巴氏杀菌、高压加工（HPP）、酶解和储存期间的非酶促糖基化。PF来源蛋白可能在其控制这些反应的属性上与天然同源物不同，因此可能导致对相同加工的不同响应。
3.1 热处理
热处理通过变性、聚集和美拉德反应破坏表位来降低致敏性，或通过暴露隐藏表位和形成新表位来增加致敏性。例如，β-乳球蛋白的IgE结合能力总体上随加热而降低，而温和加热则通过展开结构暂时增加抗原性。相比之下，酪蛋白以线性表位为主，耐热性强，加热后基本保持其IgE反应性。值得注意的是，许多研究报告称热处理反而增加了致敏性。PF来源蛋白可能在热稳定性、二硫键和半胱氨酸化学以及糖基化方面与天然同源物不同，因此在相同加工条件下，表位暴露与破坏之间的平衡可能会发生改变。直接证据仍然稀少。
3.2 高压加工（HPP）
HPP破坏非共价相互作用，改变二级和三级结构，但不改变一级结构。与热处理不同，HPP不改变线性表位，主要通过构象表位的暴露或掩蔽以及压力诱导的聚集来改变致敏性。对于β-乳球蛋白，IgE结合在200 MPa时最低，在400 MPa时最高。PF来源蛋白可能在控制这些响应的属性上与天然蛋白不同。由于HPP保留了一级结构，源自N端延伸的任何序列衍生表位原则上会在压力处理后持续存在，尽管聚集可能限制其可及性。
3.3 酶解
酶解裂解肽键，从而破坏线性和构象表位，是生产低致敏性产品最成熟的方法。水解效率取决于蛋白质对蛋白酶的敏感性，这受二硫键、糖基化和结构紧凑性控制。紧密折叠的过敏原限制了酶的可及性。PF来源蛋白可能在这些属性上与天然蛋白不同，因此在相同处理下水解程度可能不同，产生不同的肽段和表位谱，其免疫反应性无法假设。
3.4 糖基化与美拉德反应
糖基化是美拉德反应的一部分，还原糖非酶促地结合到赖氨酸的ε-氨基和N端，形成Amadori产物和晚期糖基化终末产物（AGEs），并在加热、灭菌和储存期间自发进行。它与细胞内酶促添加的糖基化在机制上不同。糖基化可以掩蔽表位并减少IgE结合，或通过暴露隐藏表位和产生新表位来增加IgE结合。在β-乳球蛋白中，糖基化通常通过表位掩蔽减少IgE结合。然而，IgE结合的减少并不能确定致敏性降低。PF来源产品携带与天然模式不同的宿主依赖性糖基化，这些差异可能改变糖基化行为。
4. PF来源蛋白的致敏性评估
PF来源蛋白的致敏性评估应用了为GMO食品建立并后来扩展到新型食品的单蛋白框架。评估是层级化的，包括审查已记录的致敏性和安全使用史、针对已知过敏原的序列同源性分析、消化率测试、血清IgE结合试验以及在必要时进行的临床研究。
4.1 审查已记录的致敏性和安全使用史
第一层级利用现有文献建立两条证据链：该蛋白是否已被报告为过敏原，以及其来源食品是否有记录的安全使用史。对于PF来源产品，这两条证据均来源于其天然同源物。然而，此证据适用于天然蛋白，重组蛋白没有独立的使用历史。因此，天然谱提供了一个稳健的基线，但结构偏差是否保留了该谱图需要在后续层级中确认。
4.2 生物信息学序列同源性分析
第二层级将目标蛋白的氨基酸序列与已知过敏原数据库进行比较，以预测IgE交叉反应的可能性。对于PF来源产品，此分析的信息含量在于重组序列偏离天然序列的区域。因为目标本身与数据库条目基本相同，搜索会返回一个微不足道的完全匹配。必须调查N端延伸或引入的序列变体是否产生了与其他过敏原匹配的新基序或改变了天然蛋白的已知表位。
4.3 体外消化率测试
第三层级评估目标蛋白被消化酶降解的速度。对于PF来源产品，此测试关注结构偏差是否改变了与天然蛋白相比的消化行为。消化率测试是比较性地应用，而非作为通过/失败标准。需要进行两项操作要求：天然对照必须在同一次运行中进行消化；由于感兴趣的偏差是局部化的，读数必须解决哪些肽段存活下来，而不仅仅是完整条带是否消失。
4.4 血清IgE结合试验
第四层级直接测量过敏患者血清中特异性IgE与目标蛋白的结合。对于PF来源产品，此试验可作为直接评估结构偏差免疫学后果的点。然而，IgE结合指示的是表位识别的变化，而非临床反应性。这类产品特有的实际困难是，阳性结果是预期中的。因为PF来源的牛奶和鸡蛋蛋白是有意复制的既定过敏原，过敏个体血清的IgE结合是预期的结果，本身并非安全信号；该试验必须解决的是相对于并行测定的天然蛋白，结合强度或表位模式的差异。两个局限性需要注意：使用对天然蛋白致敏的患者血清可能导致假阴性结果；IgE结合试验无法确定一个新表位是否能使先前非过敏个体致敏。
4.5 临床和人体激发研究
最后一层通过皮肤点刺试验和口服食物激发直接在人体中确认临床反应性。双盲安慰剂对照食物激发是诊断IgE介导的食物过敏的金标准。此层级占据最高位置，因为致敏和IgE结合不一定对应于临床反应性。
4.6 PF来源蛋白致敏性评估实践
迄今为止，上述方法仅在一例PF来源食品蛋白上得到了完整应用。对于在毕赤酵母中表达的重组人乳铁蛋白，一项基于Codex的评估结合了多项分析，结论是不需要进行血清IgE测试或临床测试。随后的一项随机双盲试验未招募过敏个体，也未测量IgE，因此未涉及IgE介导的反应性。目前尚无针对主导市场的PF来源牛奶和鸡蛋蛋白的类似可比评估公开发表。
5. 未来展望
5.1 过程依赖性致敏性与过程感知评估的必要性
PF来源产品的致敏性并非由目标序列单独固定，而是由生产过程及后续食品加工共同塑造。由于PF来源产品在基因、宿主、培养基和加工条件上各不相同，其致敏性可能因产品而异。因此，致敏性不能在纯化重组蛋白或序列层面判断，而必须在最终制剂产品中逐个评估。产品逐个评估还有一个进一步的含义：需要在批次间监测等效性声明所依据的属性。尽管目前没有直接证据表明PF来源产品在致敏性上与天然同源物存在实质性差异，但这反映了迄今为止有限的研究而非已证明的等效性。监管机构已将致敏性确定为阻碍对PF来源产品安全性得出结论的关键数据缺口。此外，尚未建立关于IgE结合、表位结构或消化稳定性的何种偏差构成等效性丧失或致敏性增加的阈值。
5.2 预测从头致敏化与向无动物评估的过渡
致敏性评估区分了两个目标：预测已致敏个体的交叉反应性和预测未致敏个体的从头致敏化。交叉反应性预测相对成熟，而从头致敏化仍知之甚少，目前尚无经过验证或国际公认的预测方法。由于PF靶点是已知过敏原的同源物，交叉反应性占主导地位；然而，源自N端延伸或非天然修饰的新表位可能引入天然蛋白中不存在的新致敏决定簇。评估致敏潜力部分依赖于动物模型，但这些模型不能完全再现人类免疫反应。因此，正在开发基于人类的替代方法，包括上皮-免疫细胞共培养、类器官和肠芯片平台。人工智能驱动的计算机模拟方法也很有前景，但标准化数据集和外部验证仍是限制因素。
5.3 PF的定义模糊性及其监管影响
PF来源产品所需的安全评估范围取决于产品如何分类，但该术语本身缺乏统一的定义。这种模糊性具有实际后果，因为它决定了致敏性评估所需的数据。当使用携带外源基因的基因改造微生物时，该路径要么属于GMO法规，要么属于新型食品法规，具体取决于活细胞或重组DNA是否存在于最终产品中。然而，对于仅通过基因组编辑修饰的微生物，其分类在各个司法管辖区仍未解决。
6. 结论
由于PF来源蛋白是已确定为过敏原的蛋白的同源物，其评估基于与天然对应物的等效性，而非识别新危害。这种等效性并非不言而喻。宿主依赖的PTMs、信号肽不完全切割、非天然二硫键模式和残留HCPs导致PF来源蛋白与天然对应物存在细微偏差。这些偏差既直接改变表位，也调节蛋白对后续加工处理的响应。已建立的层级化方案仍然是进行这种比较的有效框架，尽管每个层级都需要针对PF来源蛋白进行重新解读，并且仅靠分子终点是不够的。与食品酶的对比阐明了哪些要素可以直接沿用，哪些需要调整。出现了三个食品酶评估未涉及的要求：在最终制剂产品而非纯化蛋白中进行评估；判定等效性丧失的阈值；以及对免疫化学相关属性的批次间一致性进行控制。满足这些要求将为PF来源蛋白建立一个基于等效性的致敏性评估体系，而无需替换现有框架。与此同时，还需要在相同加工条件下生成的直接比较数据，以及PF的统一定义和监管分类。
