《EMI: Animal & Environment》：Using wild deer as sentinels reveals spatial variation in the abundance and diversity of Mycobacteria in northeast Scotland
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分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）是一类通过环境传播的细菌，包含人类和牲畜的重要病原体，以及可干扰这些疾病诊断检测的物种。不同栖息地 harbours 不同的分枝杆菌群落，因此了解反刍动物在不同栖息地接触哪些分枝杆菌属物种，对于评估潜在疾病风险
分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）是一类通过环境传播的细菌，包含人类和牲畜的重要病原体，以及可干扰这些疾病诊断检测的物种。不同栖息地 harbours 不同的分枝杆菌群落，因此了解反刍动物在不同栖息地接触哪些分枝杆菌属物种，对于评估潜在疾病风险和诊断检测干扰至关重要。鉴于野生鹿的广泛分布，其可作为哨兵，评估反刍牲畜在不同栖息地和景观中接触分枝杆菌群落的情况。研究人员利用苏格兰东北部低地和高地两个采样点捕获的野生马鹿（Cervus elaphus）和狍（Capreolus capreolus）粪便样本，采用分子方法，基于hsp65基因鉴定并表征了这些采样点的分枝杆菌多样性和群落组成。高地的分枝杆菌检出率显著低于低地。两地之间的多样性和群落组成也存在显著差异。在采样点内部，不同鹿种间的分枝杆菌群落组成存在差异，这可能源于其栖息地利用和摄食生态学的不同。对分枝杆菌多样性的表征揭示了许多新基因型，其中许多与机会性病原体物种或已知会干扰诊断检测的物种密切相关。这些发现突显了野生鹿作为哨兵的价值，有助于理解环境传播病原体（如分枝杆菌属）在不同环境中的生态学，并评估反刍牲畜的潜在暴露风险。
**论文解读：利用野生鹿作为哨兵揭示苏格兰东北部分枝杆菌丰度与多样性的空间变异**
**一、研究背景与问题**
分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）是一类广泛存在于环境中的细菌类群，包含结核分枝杆菌复合群（MTBC）和非结核分枝杆菌（NTM）。其中，MTBC成员如结核分枝杆菌（M. tuberculosis）和牛分枝杆菌（M. bovis）分别是人类结核病和牛结核病（bTB）的重要病原体。NTM虽然多数为环境腐生菌，但部分物种是机会性病原体，可感染免疫受损个体，引起慢性肺部疾病等临床综合征。在兽医领域，环境NTM暴露可因与M. bovis共享抗原而干扰bTB的皮肤试验和γ-干扰素（IFN-γ）试验，导致假阳性结果，迫使养殖户屠宰未感染bTB的动物，造成重大经济损失。此外，近年报道的NTM感染病例增多，使其被视为对人类健康的新兴威胁。
不同栖息地 harbours 不同的分枝杆菌群落，环境条件（如土壤类型、pH、海拔、土地利用）和牲畜密度均会影响环境中分枝杆菌的丰度和多样性。然而，目前尚不清楚反刍动物在不同环境中可能携带或排出哪些分枝杆菌种属。由于野生鹿（如马鹿Cervus elaphus和狍Capreolus capreolus）在英国分布广泛、数量众多，且与牲畜共享栖息地和资源，其采食生态和消化生理与反刍家畜相似，因此可作为监测反刍动物环境分枝杆菌暴露风险的理想哨兵。本研究旨在利用苏格兰东北部两个不同环境条件下的采样点，检验野生鹿粪便中分枝杆菌的检出率、多样性和群落组成是否随采样点和鹿种不同而存在差异，从而评估野生鹿作为哨兵的可行性。
**二、研究技术方法**
研究样本采集自苏格兰东北部两个地点：低地采样点位于阿伯丁郡，主要为商业针叶林（以锡特卡云杉为主），毗邻混合农业用地；高地采样点位于斯佩赛德，包括因什沼泽和阿伯内西两个自然保护区，以石楠泥炭沼泽和古老原生林地为主。研究于2023年1月至2025年5月期间，从被合法射杀的野生马鹿（n=43）和狍（n=47）直肠采集粪便样本，共90份。样本保存于RNALater或DNA/RNA Shield中，使用Qiagen DNeasy PowerSoil Pro Kit提取粪便DNA。采用针对hsp65基因（编码65kDa热休克蛋白）的PCR扩增440 bp片段，以检测分枝杆菌DNA，并用Sanger测序验证阳性结果。对29份PCR阳性样本（高地13份，低地16份）进行Illumina 2×300 bp配对末端扩增子深度测序，构建“分枝杆菌组”（Mycobacteriome）。测序数据通过DADA2流程处理生成扩增子序列变异体（ASVs），并与自建的分枝杆菌hsp65参考数据库（233条参考序列）进行BLAST比对，以93%序列一致性阈值筛选有效ASVs。随后进行α多样性（稀疏化ASV丰富度）和β多样性（基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度分析（NMDS）和相似性分析（ANOSIM））分析。同时，通过文献检索评估ASVs最相似物种的临床相关性，包括分离来源、致病性和对bTB/副结核检测的干扰情况。
**三、研究结果**
* **分枝杆菌检出率**：总体检出率为72.2%（65/90）。高地采样点检出率（38.9%，14/36）显著低于低地采样点（94.4%，51/54）（p<0.001）。同一地点内，马鹿和狍的检出率无显著差异。高地的两个保护区之间检出率亦无差异。
* **hsp65深度测序与ASV分布**：从29份样本中获得717个独特ASVs，仅16%在两个地点共有，49%仅在低地发现，35%仅在高地发现。低地马鹿和狍共享23%的ASVs，而高地仅共享8%，表明高地两鹿种间分枝杆菌群落差异更大。
* **多样性与群落组成**：稀疏化ASV丰富度范围为6至34.2。最佳模型包含地点、物种及其交互作用，表现为高地马鹿的ASV丰富度显著低于高地狍和低地两鹿种。高地的两个保护区之间无差异。NMDS和ANOSIM分析显示，对于马鹿（R=0.746, p=0.001）和狍（R=0.31, p=0.011），两个采样点的群落组成均显著不同，且马鹿的地点间差异更为明显。在两地内部，马鹿与狍的群落组成也存在显著差异（低地R=0.433, p=0.004；高地R=0.371, p=0.008）。高地两个保护区间的群落组成无显著差异。
* **临床相关分枝杆菌**：在93%一致性阈值下，ASVs最接近60种分枝杆菌参考物种。其中，与已知干扰bTB和副结核检测的物种相关的ASVs包括：M. cookii（两个地点两种鹿中均存在，一致性93.5-97.0%）、M. paraense（高地一头狍中，一致性94.3%）和MTBC成员（低地两头马鹿和高地一头狍中，一致性100%）。低地样本中含干扰检测相关ASV的比例显著高于高地（p=0.004），尤其在马鹿中明显。所有低地鹿样本至少含一个与干扰因子相关的ASV（读长比例0.71%-33.85%），而高地样本中该比例为0%-7.16%（马鹿20%，狍75%）。仅两个ASV与参考序列完全匹配（100%），分别为M. timonense（鸟分枝杆菌复合群成员，机会性病原体）和MTBC成员（因hsp65无法区分MTBC内物种，未能进一步鉴定）。
**四、讨论与结论**
研究结果表明，野生鹿粪便中分枝杆菌的携带率和群落组成存在显著空间差异，低地采样点高于高地，且鹿种间的群落组成差异在两地均存在。这些差异可能与环境条件（如土壤、海拔、土地利用）和牲畜密度相关，低地牲畜密度较高，可能增加环境中分枝杆菌的丰度。鹿种间差异则可能源于其采食生态和栖息地利用不同：马鹿主要在春季夏季食草，狍则偏爱木本和灌木植物。高地马鹿在高海拔开阔丘陵地带活动时间较长，而森林土壤通常含有更高的分枝杆菌多样性，这解释了高地马鹿ASV丰富度较低的现象。
虽然大多数ASVs与参考序列不完全匹配，表明存在许多未表征的新基因型，但发现了一些与临床相关物种密切相关的ASVs，特别是M. cookii和M. paraense等已知干扰bTB和副结核检测的物种，以及MTBC成员（推测最可能是田鼠分枝杆菌M. microti，因苏格兰野生啮齿动物中M. microti流行，且鹿为bTB的 spillover 宿主但苏格兰自2009年起具有官方无结核病（OTF）状态，感染M. bovis的可能性极低）。这些发现对兽医监测具有重要意义，因为环境NTM暴露可能导致家畜bTB检测出现假阳性，影响疾病防控和经济决策。
研究局限性包括样本量较小、机会性采样无法控制样本数、未考虑季节性变异等。尽管如此，研究仍揭示出野生鹿携带的分枝杆菌具有高多样性，且存在地点和物种间的显著差异。
**结论**：野生鹿作为哨兵揭示了苏格兰东北部不同环境中分枝杆菌传播的生态学差异，其粪便中检测到丰富的、包括潜在临床相关物种在内的分枝杆菌群落，表明野生鹿可作为监测环境传播病原体和评估反刍家畜暴露风险的有力工具。未来应在野生动物-家畜界面开展同步采样研究，以全面理解分枝杆菌在生态系统中的传播动态，并从“One Health”视角评估其风险。该论文发表于《EMI: Animal》。
