IV-C型CRISPR-Cas效应复合物识别双链DNA并启动ssDNA和RNA的附带切割

《Cell Reports》：Type IV-C CRISPR-Cas effector complexes recognize double-stranded DNA and switch on collateral cleavage of ssDNA and RNA

　　

与其他1类(class 1)系统相比，IV-C型CRISPR-Cas系统仍然是未解之谜。在此，研究人员扩展了IV-C型系统的目录，鉴定出两个系统发育上不同的分支，主要分别存在于古菌(IV-C1)或细菌(IV-C2)，可通过Cas10_IVc亚基架构加以区分。研究人员对来自Thermococcus onnurineus(Ton)和Pyrococcus abyssi(Pab)的IV-C1型系统进行了功能与结构表征。IV-C型复合物与来源于不同CRISPR阵列的crRNA组装，并识别5′-GGG-3′前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)以结合双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)靶标。靶标识别激活Cas10_IVc的HD结构域，触发金属依赖性的单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)和RNA附带切割。冷冻电镜(cryo-electron microscopy, cryo-EM)揭示，该行为可通过PAM依赖性R-loop形成所触发的HD活性位点变构对齐来解释。总之，研究结果表明，IV-C型系统通过非特异性切割移动遗传元件(mobile genetic element, MGE)复制或转录过程中产生的核酸来提供免疫。

**一、研究背景与科学问题**

CRISPR-Cas系统通过RNA引导机制为原核生物提供适应性免疫，可检测并中和包括病毒和质粒在内的移动遗传元件(MGE)。与其他1类(class 1)系统相比，IV-C型CRISPR-Cas系统的功能与结构长期未被表征。IV型系统大多由MGE编码，而IV-C型系统为染色体编码，且编码含预测HD核酸酶结构域的Cas10样大亚基(Cas10_IVc)。大多数IV-C基因座缺乏相邻CRISPR阵列、适应基因或Cas6，这引发了关于其crRNA来源(是否依赖共发生CRISPR系统的crRNA)以及靶向底物(DNA或RNA)性质的关键疑问。此前IV-C型系统的结构与功能均未被阐明，本研究旨在通过综合性生化与结构表征填补这一空白。

**二、研究内容、结论与意义**

研究人员通过比较基因组学鉴定出31个独特的IV-C型系统，发现其分为两个深分支：主要存在于古菌的IV-C1与主要存在于细菌的IV-C2。以T. onnurineus(Ton)和P. abyssi(Pab)为代表，研究人员证明IV-C效应复合物与来自基因组中多个CRISPR阵列(包括与IV-C基因座相邻及远离的阵列)的crRNA组装，识别5′-GGG-3′ PAM以结合dsDNA靶标。靶标识别激活Cas10_IVc的HD结构域，触发金属依赖性的ssDNA与RNA附带切割，而前间隔序列本身不被切割。cryo-EM结构揭示，PAM依赖性R-loop形成通过变构对齐HD活性位点而激活核酸酶。该研究确立了IV-C型为一类独特的dsDNA感知附带核酸酶防御途径，拓展了CRISPR-Cas免疫机制库，论文发表于《Cell Reports》。

**三、主要关键技术方法**

研究涉及的主要技术方法包括：(1)比较基因组学与系统发育分析(PSI-BLAST搜索、CRISPRCasTyper挖掘、MAFFT比对与IQ-Tree建树、AlphaFold 3.0结构预测)；(2)体内质粒干扰实验——将Ton与Pab的IV-C1系统异源移植至P. furiosus COM1菌株；(3)体外核酸结合与切割实验(凝胶迁移率变动分析EMSA、荧光标记底物切割检测)；(4)单颗粒冷冻电镜结构解析。样本来源包括T. onnurineus NA1、P. abyssi GE-23及P. furiosus COM1菌株，重组蛋白在E. coli BL21-AI中表达。

**四、主要研究结果**

*Type IV-C CRISPR-Cas systems share a conserved core architecture with divergent Cas10-like large subunits*：研究人员通过扩展搜索获得31个独特的IV-C型系统，发现其共享由cas10、cas11、cas7、cas5构成的保守核心基因集，仅少数基因座含cas6、适应机制或CRISPR阵列；几乎所有含IV-C型系统的基因组同时编码其他CRISPR-Cas系统。

*Phylogenetic and structural diversity of archaeal and bacterial type IV-C systems*：基于Cas7亚基的系统发育分析显示细菌与古菌IV-C型系统存在明显分化，提示存在古老的细菌-古菌水平基因转移(HGT)；细菌分支所有系统均含延长的cas10基因，其Cas10_IVc的C端结构域(CTD)与Cas11亚基结构相似，提示该模块源自III型系统。基于结构差异，研究人员将两分支命名为IV-C1(主要为古菌)和IV-C2(主要为细菌)。

*Type IV-C systems selectively recruit crRNA from co-occurring CRISPR arrays*：研究人员纯化了Ton IV-C1复合物，证实其含Cas10_IVc1、Cas7、Cas5和Cas11亚基复合物，结合的crRNA主要来自CRISPR 1、2、6阵列，严格偏好group 1重复序列，证明IV-C系统可招募宿主基因组中其他位置CRISPR阵列产生的crRNA。

*PAM-dependent DNA interference in vivo*：将Ton和Pab IV-C系统移植至P. furiosus后，两者均对含互补前间隔序列及5′-GGG-3′ PAM的质粒赋予约25倍转化效率降低，且不依赖靶区转录，证明其靶向DNA；PAM突变为5′-CCC-3′后干扰消失，HD基序突变体(HDm)丧失干扰能力，证明HD结构域为DNA干扰所必需。

*Target recognition triggers collateral ssDNA and RNA cleavage*：体外实验显示分离的Cas10