野生西部黑猩猩中系统性苍白密螺旋体感染的分子学和血清学证据

《iScience》：Molecular and serological evidence of systemic Treponema pallidum infection in wild western chimpanzees

　　亮点：
- 在野生黑猩猩的遗骸中检测到了抗苍白密螺旋体（Anti-Treponema pallidum）抗体和该病原体的DNA。
- 实验室数据和野外视频显示黑猩猩患有严重的系统性密螺旋体病。
- 密螺旋体在猿类中的传播对保护工作以及消除雅司病（yaws）的努力产生了影响。

摘要：
人类密螺旋体病是由密切相关的密螺旋体属（Treponema）物种引起的慢性疾病。越来越多的证据表明，非人类灵长类动物中也存在类似于雅司病的苍白密螺旋体亚种（Treponema pallidum subsp. pertenue）感染，这引发了人们对病原体在自然生态系统中持续存在的担忧。本研究通过分子和血清学分析，调查了西部黑猩猩（Pan troglodytes verus）的密螺旋体感染情况。使用经过验证的血清学检测方法，在所有黑猩猩中都检测到了抗T. pallidum抗体；而分子检测则在一只黑猩猩的椎骨样本中发现了T. pallidum DNA，这支持了系统性扩散的观点。通过将法医发现与回顾性野外视频观察结果相结合，我们发现同一黑猩猩的骨骼受累情况与其严重的临床表现（包括生殖器病变和面部色素脱失）之间存在一致性。这些发现提供了将系统性密螺旋体传播与野生濒危大猿严重疾病联系起来的罕见证据，并强调了加强监测对于野生动物保护以及评估人类雅司病根除工作潜在影响的重要性。

引言：
人类密螺旋体病是全球范围内一个重要的健康问题，造成了严重的疾病负担。这些慢性感染由苍白密螺旋体亚种（T. pallidum, pertenue, endemicum）和卡雷图姆密螺旋体（T. carateum）引起，可通过性接触或皮肤接触传播。这些细菌优先感染黏膜和胶状组织，导致系统性扩散。若不进行治疗，这些感染会导致严重的神经系统、心血管系统、内脏器官和骨骼并发症。由T. pallidum ssp. pallidum引起的梅毒是主要的性传播人类密螺旋体病，2020年有超过710万成人受到影响（https://www.who.int/fr/news-room/fact-sheets/detail/syphilis）。其他地方性密螺旋体病，包括雅司病、贝杰尔病（bejel）和品塔病（pinta），传统上被认为是非性传播疾病，尽管也有报道指出贝杰尔病相关感染可能通过性途径传播。世界卫生组织已经启动了全球根除雅司病的计划（https://www.who.int/Fr/News-Room/Fact-Sheets/Detail/Yaws）。然而，这些根除工作面临多个挑战，包括治疗分配有限、诊断资源不足以及可能存在非人类宿主。

历史背景：
历史上，人们认为T. pallidum仅存在于人类体内。1963年，在几内亚的一只绿狒狒（Papio papio）体内分离出了这种细菌，这一发现挑战了这一观点。这种被称为Fribourg-Blanc的菌株在抗原性和遗传上与人类雅司病相似，并且对人类和仓鼠（Mesocricetus auratus）都具有致病性。几十年来，这一发现一直被认为是孤立的，因为很少对非人类灵长类动物进行密螺旋体感染的调查。然而，最近的研究证实，非人类灵长类动物也容易感染密螺旋体，支持了Fribourg-Blanc的初步结论。例如，在塞内加尔，通过血清学检测发现绿狒狒感染了密螺旋体；同样，在坦桑尼亚，来自8个不同物种的289只非人类灵长类动物中也观察到了T. pallidum感染。这些观察表明T. pallidum subsp. pertenue感染在非洲范围内广泛传播，并存在于多种非人类灵长类动物中，包括狒狒（Papio cynocephalus, P. papio, P. anubis）、曼格贝伊猴（Cercocebus sp.）、绿猴（Chlorocebus sabaeus）、蓝猴（Cercopithecus mitis）、帕塔斯猴（Erythrocebus patas）和西部红 colobus 猴（Piliocolobus badius）。2015年，塞内加尔发生了一次密螺旋体病流行，发现绿猴和P. papio中存在性传播的TPE感染，其临床病变与人类梅毒相似。遗传分析显示该菌株与Fribourg-Blanc几乎相同，并且与TPE密切相关，这质疑了T. pallidum严格限于人类的观点，揭示了其潜在的人畜共患病特征。2019年的一项研究明确建立了TPE与野生西部黑猩猩（Pan troglodytes verus）雅司病样病变之间的联系。在喀麦隆、乌干达和科特迪瓦的黑猩猩以及喀麦隆、加蓬和刚果共和国的大猩猩（Gorilla gorilla）中也观察到了其他密螺旋体感染。最近在塞内加尔的发现显示，44.8%的西部黑猩猩粪便样本中检测到了特异性T. pallidum抗体。

这些发现强调了继续监测的必要性，以评估类似雅司病的密螺旋体病对非人类灵长类动物种群的影响，因为它们的健康状况受到了影响。这对于根据国际自然保护联盟（IUCN）被列为濒危或极危物种的大猿尤为重要。此外，非人类灵长类动物中几乎与雅司病相同的密螺旋体菌株的传播可能对世界卫生组织的雅司病根除工作构成挑战。尽管目前尚未记录到人类因接触非人类灵长类动物而感染密螺旋体的病例，但仍需监测潜在病例。

研究方法：
本研究分析了三只死亡黑猩猩的死后样本，通过分子和血清学方法检测密螺旋体感染及其向严重疾病的进展。

结果：
- 分析了三只黑猩猩的三块椎骨和四颗牙齿样本（图1）：一只死亡于2016年5月的雌性黑猩猩（female 1）提供了两块椎骨和一颗臼齿；一只死亡于2012年3月之前的雄性黑猩猩（male 1）提供了一颗臼齿和一块椎骨；另一只死亡于2019年2月的雄性黑猩猩（male 2）提供了一颗门齿。样本取自骨骼，因此软组织已不存在。这些黑猩猩的死因未被确定。

- 在一只雌性黑猩猩的椎骨中检测到了T. pallidum DNA：目标内部对照序列（TISS）提取的控制显示中位数Ct值为31.08和32.56，证实了DNA的成功提取。提取的DNA通过qPCR针对polA和flaA进行检测。来自female 1的三块椎骨DNA样本中，polA（Ct 30.72 ± 1.56, 31.23 ± 0.80, 31.98 ± 0.46）和flaA（Ct 32.28 ± 1.23, 33.72 ± 1.54, 34.36 ± 0.48）均为阳性。这些Ct值对应于两次qPCR测量的平均值±标准差（SD）。其他样本，包括female 1的牙髓以及male 1和2的样本，均为阴性。针对TENDBA_0136基因进行了嵌套PCR检测（图2），在female 1的椎骨中观察到了一个435 bp的中等强度条带，与预期目标大小一致；但在第一个孔中出现了非特异性条带。对PCR产物的测序尝试未能获得可解释的序列。

- 血清学研究：从死后牙髓和椎骨样本中回收了免疫球蛋白。总IgG和IgM检测结果见表S2。female 1的牙髓中IgG中位值为1,400 pg/mL（四分位数范围[IQR]：800–2,000），椎骨中位值为2,000 pg/mL（IQR：1,800–6,100）；male 1的牙髓中IgG为3,700 pg/mL，椎骨中IgG为2,750 pg/mL（IQR：1,400–8,500）；male 2的IgG水平为零。重组和天然密螺旋体抗原显示了预期的蛋白质谱带。

- 自动Western blot检测：首先分析了Western blot迁移标准品。随后，在预期分子量（MW）处评估了每个样本的信噪比（S/N），以确定是否存在抗T. pallidum抗体。被认为是抗T. pallidum阳性的样本显示出显著高于一系列阴性梅毒血清（n = 10）获得的中位S/N值。阳性人类血清在70 kDa处显示出一个明显的条带。用自动Western blot系统观察到的70 kDa信号与预期的77 kDa重组抗原一致，轻微差异可能是由于传统SDS-PAGE和毛细管电泳系统之间的迁移差异所致。

- 使用mini line blot确认抗T. pallidum抗体：在重组抗原检测中，阴性对照显示无条带（S/N中位数 = 23.25, IQR：10.9–31.7）；阳性对照显示一个70 kDa条带，与预期MW一致。在female 1的牙髓（S/N = 148.8）和椎骨（S/N = 83.7, IQR：74.5–92.9）、male 1的椎骨（S/N = 97.45, IQR：62.1–132.8）以及male 2的牙髓（S/N = 55.9）中检测到了相同70 kDa的条带。这些数据表明female 1（牙髓和椎骨）、male 1（椎骨）和male 2（牙髓）中存在抗T. pallidum抗体。使用天然T. pallidum抗原进行Western blot时，毛细管中的样本迁移未成功。尽管多次使用天然抗原和阳性梅毒血清进行测试，结果仍不明确，无法使用Jess Western blot进一步验证提取的抗体。

结论：
- 本文通过分子和血清学分析，研究了西部黑猩猩的死后样本，以评估密螺旋体感染及其向严重疾病的潜在进展。
- 在female 1的椎骨样本中检测到了T. pallidum阳性结果，并且在椎骨和牙髓中也获得了阳性的血清学结果。虽然确定死亡的确切原因仍然是野生动物法医学中的经典挑战，但分子、血清学和生前行为数据的一致性强烈表明该个体在死亡时患有严重的、致残性的晚期密螺旋体病。相比之下，只有male 1和male 2的血清学检测结果为阳性。男性1的牙齿和椎骨样本均检测出阳性结果，而男性2仅牙齿样本呈阳性，这证实了他们感染了苍白密螺旋体（T. pallidum）；然而，关于这些个体死亡原因的确定性结论仍不确定（表1）。

| 个体 | 样本 | T. pallidum DNA检测 | 免疫测定 | 西部印迹 | 迷你线性印迹 | 可能的感染状态 |
|--------------|----------------|------------------|------------------|------------------|------------------|
| 女性1 | 牙齿 | 阴性 | 高IgG和低IgM | 阳性 | 阳性 | 深度梅毒感染 |
| | 椎骨 | 阳性 | 高IgG和低IgM | 阳性 | 阳性 | 深度梅毒感染 |
| 男性1 | 牙齿 | 阴性 | 高IgG和低IgM | 阳性 | 阳性 | 深度梅毒感染 |
| | 椎骨 | 阴性 | IgG和IgM均阴性 | 阳性 | 阳性 | 结果矛盾（抗体结果不一致） |
| 男性2 | 牙齿 | 阴性 | IgG和IgM均阴性 | 阳性 | 阳性 | 结果矛盾（抗体结果不一致） |

**表1：基于分子和血清学结果的三种黑猩猩可能的苍白密螺旋体感染状态**

**讨论**
值得注意的是，所有样本均为法医样本，来源于几年前（某些甚至超过十年前）在野外收集的骨骼，并且一直保存在常温环境中。由于核酸和蛋白质的降解以及环境污染，样本的保存状况较差，这可能影响了检测结果。我们的发现证实了猿类也会感染梅毒，这与先前的研究结果一致。血清学分析在所有个体中都检测到了抗苍白密螺旋体抗体。这些抗体在女性1和男性1的牙髓及椎体中均被西部印迹和迷你线性印迹所证实，而在男性2的牙髓中也有发现。这强烈表明这些个体在其生命周期中曾感染过苍白密螺旋体。总免疫球蛋白检测显示，女性1和男性1的IgG水平较高，而IgM水平较低，这支持了他们长期或反复接触苍白密螺旋体的观点，而非急性初次感染。在部分感染个体中检测到IgM抗体，这可能反映了慢性梅毒感染过程中低水平或波动的免疫反应。在男性2中，仅牙髓中检测到抗苍白密螺旋体抗体，而IgG和IgM均为阴性，这种差异可能是由于牙髓样本数量极少且性质不均匀所致，而非方法错误。我们的抗体检测方法具有不易受污染或产生假阳性的优势，但IgM和IgG的特异性不足以鉴定梅毒的具体亚型。

分子分析在女性1的椎骨 marrow中检测到了苍白密螺旋体，这与晚期梅毒感染引起的骨骼病变相符。骨组织中存在梅毒DNA，加上牙髓和骨髓中的抗体，表明她处于感染晚期。虽然我们不能完全排除其他并发症是直接导致死亡的原因，但这种严重的骨骼病变突显了未得到治疗的梅毒对野生类人猿的致命威胁。尽管晚期梅毒常在海绵状骨组织中形成梅毒瘤，但在检查这块古老椎骨时并未观察到宏观病变。此外，牙髓中未检测到苍白密螺旋体DNA，这与梅毒感染的生物学特性相符，表明死亡时可能未发生菌血症（因为梅毒螺旋体通常仅在早期感染时存在于血液中）。事后在塞内加尔的珍妮·古道尔研究所拍摄的视频显示，女性1经常触摸和嗅闻自己的手指，其手指出现红肿和病变，符合梅毒感染的特征（图5）。面部色素沉着也是晚期梅毒的典型症状。该个体表现得疲倦，经常休息。晚期骨骼感染与观察到的行为和临床症状（如接触生殖器、嗜睡和面部色素沉着）高度一致，这印证了死后分子证据、血清学数据和回顾性行为观察结果的一致性。这些方法共同提供了一个综合框架，用于解释野生类人猿系统性梅毒感染及其多系统临床表现。

**图5：2015年4月25日，丹德费洛社区自然保护区的雌性1**
*注：图例包含详细说明。*

**背景信息**
最近的一项研究表明，同一保护区44.8%的西非黑猩猩体内存在抗苍白密螺旋体抗体，表明该群体中梅毒螺旋体仍在活跃传播。本研究中有一只个体在2016年死亡，表现出晚期感染症状，这进一步支持了梅毒螺旋体在该地区已传播多年的观点。2016年，塞内加尔尼奥科洛-科巴国家公园的绿猴中爆发了性传播梅毒（venereal TPE）疫情，并次年扩散到几内亚狒狒。基因组分析显示该病原体的突变速度加快，表明其传播范围较广。2016年研究的绿猴群体距离我们当前研究地点约88公里，且发现了类似人类梅毒的病变，提示梅毒螺旋体可能在物种间传播。尽管分析的骨骼样本与直接临床诊断无直接关联，但先前的研究报告指出受感染的黑猩猩存在明显健康问题，表明梅毒感染对它们的身体健康和生存有严重影响。西非黑猩猩的数量仅约5.3万只，被IUCN红色名录列为极危物种。因此，梅毒感染对其健康和生存构成严峻威胁，同时可能影响其社会行为和繁殖能力，正如大猩猩和橄榄狒狒（P. anubis）所遭遇的情况。加强对类人猿的健康监测不仅有助于保护它们，也有助于其保护工作。控制这种病原体的传播对于理解其对人类群体的潜在传播风险至关重要，因为监测不足可能导致高度传染性的疫情爆发。另一个关键问题是，类人猿是否可能成为人类雅司病（yaws-like TPE）的宿主。在西非，类人猿感染的是Fribourg-Blanc菌株，该菌株与人类雅司病病原体基因相似，具有致病性。

**研究的局限性**
可用生物材料（尤其是牙髓和骨骼提取物）极为有限，限制了重复分析和应用补充检测方法（如更全面的测序技术）的可能性。本研究使用的血清学检测方法最初是为人类免疫球蛋白开发的，由于缺乏实验感染个体的参考血清，无法在黑猩猩中进行物种特异性验证。此外，由于骨骼样本的严重降解以及死后保存方法的局限性，未在椎骨样本中观察到典型的梅毒晚期病变。

**资源联系**
如需更多信息或资源，请联系Oleg Mediannikov（[e-mail]）。

**数据及代码共享**
- 本文报告的数据可应请求由主要联系人提供。
- 本文未包含原始代码。
- 任何重新分析数据所需的信息也可向主要联系人请求。

**致谢**
我们感谢Masse Sambou和Sacy Nadaradjane在材料准备方面的宝贵帮助，并感谢塞内加尔水资源、森林、狩猎与土壤保护部门（Direction des Eaux, Forêts, Chasses et de la Conservation des Sols）允许我们收集用于研究的黑猩猩样本。同时感谢珍妮·古道尔研究所塞内加尔分部的野外助手和志愿者在丹德费洛社区自然保护区（Dindefelo Community Nature Reserve）的帮助。本研究得到了地中海医院大学研究所（Institut Hospitalo-Universitaire IHU）、法国国家研究署（ANR）“未来投资”计划（ANR-10-IAHU-03项目）、欧洲区域发展基金（FEDER PRIMI）以及普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区（Région Provence-Alpes-C?te d’Azur）的支持。

**作者贡献**
概念设计：C.L.、H.O.H.、F.F. 和 O.M.
方法学：C.L.、H.O.H.、F.F. 和 O.M.
软件开发：C.L.、H.O.H. 和 N.O.
数据分析：C.L.、H.O.H.、N.O. 和 O.M.
调查实施：C.L.、H.O.H.、L.D.、M.L.、R.A.H.-A.、F.F. 和 O.M.
资源管理：C.L.、L.D.、M.L.、R.A.H.-A.、F.F. 和 O.M.
论文撰写及修订：所有作者
经费获取：F.F. 和 O.M.

**利益声明**
作者声明无利益冲突。

**关键资源列表**
- **试剂和资源**
- **抗体**：绵羊抗人IgG、IgA和IgM抗体（偶联HRP），Jackson ImmunoResearch，英国（Cat# 109-035-064，RRID: AB_2337583）
- **生物样本**：本研究收集的黑猩猩死后骨骼标本（椎骨和牙齿），以及珍妮·古道尔研究所塞内加尔分部的骨骼收藏
- **化学试剂和重组蛋白**：重组苍白密螺旋体融合抗原（p15、p17、p47），Antibodies-Online GmbH，德国（Cat# ABIN934736）；天然苍白密螺旋体DAL-1粗抗原

**伦理声明**
黑猩猩样本取自塞内加尔丹德费洛生物站的珍妮·古道尔研究所骨骼收藏。样本运输获得了塞内加尔环境和生态转型部（Ministère de l’Environnement et de l’écologie Transitions）的许可（许可证编号0068/IREF/KDG，发证日期2025年4月8日）。人类血清样本来自马赛大学医院（AP-HM）的常规诊断剩余样本。本研究仅使用了完全匿名的生物样本，未涉及患者。根据法国公共卫生法L.1121-1条等规定，基于常规护理中收集的匿名剩余样本的研究无需专门伦理委员会或机构审查委员会的批准。患者被告知样本可能被用于研究目的，并可通过医院数据保护官员提出异议。

**样本来源**
- 黑猩猩样本来自塞内加尔丹德费洛社区自然保护区。
- 人类血清样本来自马赛大学医院（AP-HM）的常规诊疗过程中剩余的血清。

**方法细节**
所有实验均在配备负压环境的实验室中进行，专门用于此类样本（古微生物学和古血清学分析）。分析过程中未同时添加阳性对照。DNA提取方法按照先前描述的方法进行。对于每个样本，大约30毫克的材料被重新悬浮在1毫升的裂解缓冲液中（包含0.45 M EDTA、pH 8.0和0.25 mg/mL蛋白酶K），并加入1微升的目标内控序列（TISS，一种外源性合成DNA）以监测提取效率。在37°C下使用热混频器（500转/分钟）孵育15小时后，DNA通过高盐盐酸胍结合缓冲液捕获在硅胶膜上，并通过Qiagen MinElute Silica Spin柱进行纯化。纯化后的DNA随后用25微升无核酸酶的水洗脱。为了质量控制，使用Qubit HS试剂盒对总DNA进行了定量分析。所有DNA样本均通过定量PCR（qPCR）针对T. pallidum的polA和flaA基因进行检测（见表S1），该实验在CFX Opus实时PCR系统（Bio-Rad Laboratories，美国赫拉克勒斯）上进行。反应液中包含5微升DNA、10微升LightCycler 480 Probes Master（罗氏，瑞士巴尔斯）、3.5微升无DNase/RNase的水、0.5微升探针（5微摩尔）和0.75微升引物（20微摩尔）。扩增过程为95°C持续10分钟，随后是40个循环，每个循环包括95°C 10秒和60°C 30秒。

提取的DNA通过嵌套PCR扩增，目标基因为T. pallidum的染色体基因（TENDBA_0136），具体方法如表S1所述。PCR产物使用Macherey-Nagel平板（Macherey-Nagel EURL，法国霍尔德特）进行纯化，并使用BigDye Terminator Cycle测序试剂盒（Thermo Fisher Scientific）在自动化测序仪（Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer，Thermo Fisher Scientific）上进行测序。测序程序为95°C持续15分钟，随后是25个循环，每个循环包括95°C 30秒、50°C 5秒和60°C 3分钟。

蛋白质提取按照之前的方法进行。简而言之，样本在200微升乙二胺四乙酸（EDTA）中孵育，并进行超声处理（5次，每次1分钟，6000焦耳），然后在4°C下摇动过夜。离心（30分钟，17,000g，室温）后，收集上清液（EDTA组分）并储存于-20°C。剩余的沉淀物用无菌蒸馏水洗涤两次，重新悬浮在100微升50 mM碳酸氢铵（pH 7.4）中，并在75°C下孵育48小时。离心（30分钟，17,000g）后，收集上清液（碳酸氢盐组分）并储存于-20°C。EDTA和碳酸氢盐组分合并后，使用2 kDa MWCO透析盒在50 mM碳酸氢铵中透析两次（每次4小时，然后过夜）。透析后的提取物在-80°C下冷冻干燥24小时，得到的冻干物质重新悬浮在30微升1X DPBS（Thermo Fisher Scientific）中并储存于-20°C直至分析。

### T. pallidum的总IgG和IgM以及特异性IgA、IgG和IgM的定量

#### ELISA
总IgM和IgG通过ELISA使用免疫测定试剂盒（Abcam，英国剑桥）进行测量。人IgM ELISA试剂盒（ab214568）和人IgG ELISA试剂盒（ab100547）按照制造商的协议操作。尽管这些ELISA试剂盒是为人类免疫球蛋白设计的，但由于灵长类动物之间IgG和IgM结构的高度保守性，以及预期中的试剂盒组分与黑猩猩免疫球蛋白的交叉反应性，因此认为它们也可以用于黑猩猩样本。

#### 自动化Western blot
Jess? Simple Western系统（ProteinSimple，美国圣何塞）是一个基于毛细管的分离和纳米免疫测定的自动化系统。使用了两种T. pallidum抗原。第一种是商业化的重组抗原（ABIN934736）（Antibodies-Online GmbH，德国亚琛），由T. pallidum的三种主要蛋白质（p15、p17、p47）融合而成，分子量为77 kDa。第二种是从实验感染了T. pallidum的兔子睾丸组织中提取的粗抗原制备物DAL-1。选择DAL-1抗原是因为T. pallidum的主要免疫原蛋白在不同亚种间高度保守，包括引起雅司病的菌株，这使得抗体检测具有可靠的血清学交叉反应性。细菌通过Percoll密度梯度离心纯化，然后洗涤和超声处理以制备抗原提取物。这种粗提取物用于检测抗T. pallidum抗体，通过样品抗体与固定的梅毒螺旋体蛋白结合来实现。两种蛋白质均使用12%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳。

#### 抗梅毒螺旋体IgA、IgM和IgG的检测
使用Jess? Simple Western系统（ProteinSimple）和Jess? 12–230 kDa分离模块（SM-W004，ProteinSimple）进行Western blot。所用协议与制造商提供的相同。Western blot使用DAL-1菌株的蛋白质（0.8 μg/μL）和重组蛋白质（0.5 μg/μL）进行。使用结合HRP的山羊抗人IgG、IgA和IgM抗体（1:500稀释）（Immunology Jackson ImmunoResearch，英国伊利）来显示一级抗体与抗原的结合，并用过氧化物/鲁米诺-S（ProteinSimple）进行化学发光显示。由于灵长类动物之间免疫球蛋白结构的高度保守性，预期会与非人类灵长类动物的免疫球蛋白（包括黑猩猩IgG和IgM）存在交叉反应，因此使用了抗人二级抗体。该测定的性能使用之前通过商业Western blot（Euroimmun，德国吕贝克）确认为抗T. pallidum抗体阳性的血清以及阴性对照血清进行了验证。还包括两个阳性对照（梅毒血清的1:5000稀释）和两个阴性对照。

#### Mini Line Blot
Mini Line Blot通过结合T. pallidum的天然抗原和重组抗原制备。金黄色葡萄球菌作为阳性对照（非特异性结合人类免疫球蛋白），阴性对照包括脱脂牛奶和阴性梅毒血清。该技术的操作方法如之前所述。向孔中添加1微升血清和15微升提取的抗体（用PBST-M 0.5%稀释至1毫升），然后加入结合辣根过氧化物酶的抗人IgG、IgA和IgM抗体（1:1000稀释在0.5% PBST-M中）以及1毫升过氧化物/鲁米诺（1:1）。为了避免与阳性血清的交叉污染，提取的抗体样本分别进行测试。

#### 定量和统计分析
#### ELISA信号定量和验证
从ELISA试剂盒获得的吸光度值根据制造商的说明根据标准曲线进行定量，浓度值以中位数和四分位间距（IQR）表示。自动化Western blot的数字图像使用Compass for SW软件（ProteinSimple）进行分析，检测到的蛋白质的定量数据以化学发光强度和信噪比报告。最后，对于Mini Line Blot检测，使用Fusion FX系统（VILBER，法国马尔讷拉瓦莱）对条带进行成像，并使用ImageQuantTL软件（Witec，瑞士苏尔塞）进行定量，化学发光强度以任意单位（A.U.）表示，阳性切点阈值设定为2,000 A.U.。所有绘制在条形图中的数据（图3B和4B）代表离散的单个样本值或单次提取重复值。不同个体之间的数据没有进行统计合并，因此不适合计算样本平均值或标准误差条。

### 补充信息（1）
PDF（1.15 MB）
文档S1、图S1和表S1及S2