具核梭杆菌刺激的口腔鳞状细胞癌细胞来源外泌体通过ROS/NF-κB/ICAM1轴诱导淋巴管内皮细胞促黏附表型

《Microorganisms》：Fusobacterium nucleatum-Stimulated OSCC Cell-Derived Exosomes Induce a Pro-Adhesive Phenotype in Lymphatic Endothelial Cells via the ROS/NF-κB/ICAM1 Axis

　　

具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F. nucleatum）在调控口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞与淋巴管内皮细胞（LECs）间外泌体介导的通讯中的作用仍知之甚少。研究人员在OSCC组织中确认了F. nucleatum的存在，并发现其诱导OSCC细胞发生炎症及囊泡相关转录改变。外泌体经差速超速离心分离，定量分析显示F. nucleatum刺激增加了OSCC细胞的外泌体产量。体外实验中，以F. nucleatum刺激的OSCC细胞来源外泌体（Fn-Exo）预处理LECs，增强了OSCC细胞对LEC单层的黏附。Fn-Exo上调LECs中细胞间黏附分子1（ICAM1）表达，ICAM1阻断部分降低了Fn-Exo诱导的OSCC细胞对LECs的黏附。Fn-Exo增加LECs内活性氧（ROS）蓄积，促进NF-κB p65磷酸化及核转位。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）减弱Fn-Exo诱导的ROS蓄积与NF-κB活化，NAC与NF-κB抑制剂BAY 11-7082均降低ICAM1上调并部分削弱OSCC细胞对Fn-Exo处理LECs的增强黏附。上述药理抑制实验支持ROS/NF-κB/ICAM1信号参与Fn-Exo诱导的促黏附表型。综上，F. nucleatum与OSCC细胞外泌体产量增加相关，且Fn-Exo增强OSCC细胞与LECs间的黏附相互作用。

研究背景与立项依据

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部常见恶性肿瘤，颈淋巴结转移（LNM）倾向高，是决定患者预后的关键因素。日益增多的证据表明口腔微生物群参与OSCC进展，其中具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F. nucleatum）作为肿瘤相关菌在口腔癌中被频繁关联。该菌可调节肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及免疫应答，并在OSCC浸润边缘富集，在有颈淋巴结转移的肿瘤中丰度更高。然而，F. nucleatum是否通过肿瘤-淋巴管内皮细胞互作重塑淋巴转移微环境尚不清楚。外泌体是细胞间通讯关键介质，肿瘤来源外泌体可调控微环境重塑与转移前生态位形成；已有报道F. nucleatum感染会改变肿瘤细胞外泌体分子 cargo 并增加分泌量。淋巴管内皮细胞（LECs）在淋巴结转移中并非被动管道，而是肿瘤-淋巴系统互作的主动界面，肿瘤来源外泌体可被LECs摄取并调节淋巴管生成相关功能。ICAM1（细胞间黏附分子1）是内皮炎症反应与细胞互作的主要黏附分子，介导癌细胞与LECs互作参与哨兵淋巴结转移。基于此，研究人员开展本研究，探究F. nucleatum刺激的OSCC细胞来源外泌体是否重塑LECs促黏附状态及其机制。论文发表于《Microorganisms》。

主要关键技术方法

研究人员使用两独立OSCC转录组队列（GEO：GSE184616，15例；GSE275870，108例）经PathSeq流程注释细菌读数，并以人OSCC组织芯片行F. nucleatum荧光原位杂交（FISH）验证定植；采用ATCC来源CAL27、SCC15（OSCC细胞）与LECs，以F. nucleatum ATCC 25586（MOI 50）刺激48小时，E. coli DH5α作非致病对照；差速超速离心分离外泌体（Con-Exo、Ec-Exo、Fn-Exo），经电镜、纳米颗粒追踪（NTA）、Western blot表征；以PKH26标记外泌体行流式与共聚焦观察LECs摄取；以PKH26标记OSCC细胞行LECs单层黏附实验，并用抗ICAM1中和抗体、NAC（ROS清除剂）、BAY 11-7082（NF-κB抑制剂）干预；RT-qPCR、Western blot、DCFH-DA ROS染色、p65免疫荧光核质比分析检测分子表型；RNA-seq（CAL27经F. nucleatum刺激）行差异基因与GSEA分析。

研究结果

3.1 F. nucleatum Induces an Inflammatory Transcriptional Program in OSCC Cells

研究人员在两个OSCC数据集中检出Fusobacterium属读数（GSE184616中46.7%，GSE275870中24.0%），FISH在组织水平确认F. nucleatum存在。MOI筛选确定50不引起显著凋亡。RNA-seq显示刺激后PCA明显分离，202个差异基因（108上/94下），KEGG富集于TNF、NF-κB、NOD样受体、TLR通路；GSEA正向富集TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB、INFLAMMATORY_RESPONSE、IL6_JAK_STAT3_SIGNALING；RT-qPCR验证TLR2、RELB、IL6、PTGS2、TNFAIP3上调，囊泡运输基因（PLD1、UGCG、MYO1B、STX11、PIGR、RAB3IL1）同步上调。结论：F. nucleatum刺激关联OSCC细胞炎症信号与囊泡运输转录改变。

3.2 F. nucleatum Stimulation Increases Exosome Yield from OSCC Cells

差速超速离心获Con-Exo、Ec-Exo、Fn-Exo，电镜呈典型杯状，NTA显示粒径无差异，但Fn-Exo颗粒浓度（CAL27：8.57±0.23×10⁷ particles/mL）显著高于Con-Exo（4.47±0.21×10⁷）与Ec-Exo（4.63±0.31×10⁷），按收尾细胞数归一化产量仍高；BCA总蛋白更高；WB阳性HSP70、TSG101、CD63，阴性histone H3。结论：F. nucleatum刺激提升OSCC细胞条件培养基回收外泌体产量。

3.3 Fn-Exo Are Internalized by LECs and Enhance the Pro-Adhesive Phenotype of LECs

PKH26-Fn-Exo与LECs共孵育，流式与共聚焦示12小时摄取近平台。黏附实验示Fn-Exo预处理LECs后，CAL27与SCC15细胞黏附数较Con-Exo显著增多，Ec-Exo无进一步增加；Fn-Exo不影响LEC活力、形态、通透性。结论：Fn-Exo被LECs内化并诱导强于对照的促黏附表型。

3.4 ICAM1 Contributes to the Adhesive Phenotype of LECs Induced by Fn-Exo

RT-qPCR与WB示Fn-Exo上调LECs中ICAM1 mRNA与蛋白（VCAM1略升）。抗ICAM1中和抗体预处理部分降低Fn-Exo增强的OSCC细胞黏附。结论：ICAM1功能参与Fn-Exo诱导LEC促黏附，但非唯一介质。

3.5 Fn-Exo Promote ICAM1 Expression and a Pro-Adhesive Phenotype in LECs Through ROS/NF-κB Signaling

DCFH-DA示Fn-Exo增LEC内ROS，NAC消除该效应；Fn-Exo促p65核转位与磷酸化比升高，NAC与BAY 11-7082均抑之；二者并降ICAM1 mRNA/蛋白。黏附实验示NAC与BAY 11-7082各部分逆转Fn-Exo增强的黏附。结论：ROS蓄积→NF-κB活化→ICAM1上调→促黏附，ROS/NF-κB/ICAM1为Fn-Exo作用的重要通路。

讨论与结论翻译

讨论部分指出，本研究将肿瘤来源外泌体确立为链接F. nucleatum刺激OSCC细胞与LEC促黏附表型的中介，扩展既往淋巴管暴露外泌体调控内皮行为认知；ICAM1部分阻断说明另有协同黏附分子；ROS依赖NF-κB调ICAM1与多内皮模型一致。研究局限在于以体外OSCC-LEC模型为主，F. nucleatum具体组分及Fn-Exo中诱导ROS的cargo未鉴定，未来需在体验证Fn-Exo淋巴结聚集、信号通路遗传学验证及临床队列关联。

结论原文浓缩翻译：综上，F. nucleatum见于OSCC组织并诱导OSCC细胞炎症与囊泡相关转录改变；F. nucleatum刺激增加回收外泌体产量，所得Fn-Exo被LECs内化并增强OSCC细胞对LEC单层黏附；Fn-Exo处理伴随LECs内ROS蓄积、NF-κB活化与ICAM1上调；ROS清除、NF-κB抑制及ICAM1阻断均部分削弱增强黏附表型。上述发现支持ROS/NF-κB/ICAM1信号参与Fn-Exo诱导的LEC促黏附表型。