PA0290与PelD共表达增强铜绿假单胞菌生物被膜形成

《Microorganisms》：Co-Expression of PA0290 and PelD Enhances Pseudomonas aeruginosa Biofilm Formation

　　

单个二鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclase，DGC）如何在细菌c-di-GMP网络中产生特异性输出尚不清楚。研究人员表征了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中一种PAS-PAC-GGDEF蛋白PA0290，并考察其与c-di-GMP受体PelD的关系。单独缺失或过量表达PA0290均不显著影响生物被膜形成。细菌腺苷酸环化酶双杂交（bacterial adenylate cyclase two-hybrid，BACTH）筛选将PelD鉴定为PA0290的候选互作蛋白，PA0290与PelD共表达显著增强静态与流动腔生物被膜形成。纯化的PA0290产生一个HPLC产物峰，其保留时间与真实c-di-GMP标准品高度吻合；而将保守GGEEF基序替换为GGAAF后，产物生成减少，且PA0290–PelD共表达所增强的生物被膜表型被削弱。PA0290–PelD共表达对批量c-di-GMP应答性cdrA-lux报告基因未产生持续激活。临床分离株亦呈现异质性生物被膜形成能力及可变的PA0290与pelD转录丰度。综上，这些发现支持PA0290与PelD在生物被膜调控中存在功能关联。缺乏批量c-di-GMP应答报告基因的持续激活表明，该表型未伴随c-di-GMP应答性转录的普遍升高。

研究背景与立项依据：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物被膜生长促进持续感染并显著提升抗菌耐受性。第二信使环二鸟苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）通过GGDEF结构域二鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclase，DGC）与EAL/HD-GYP磷酸二酯酶的拮抗活性协调游动与生物被膜生活方式转换。该菌拥有异常庞大的c-di-GMP网络，PA0290作为保守GGDEF蛋白虽被预测具DGC活性，但其如何连接特定生理输出未知。当前模型区分全局c-di-GMP调控与局部信号传导（即代谢酶优先与邻近受体/靶标通讯）。PelD是内膜c-di-GMP受体，负责Pel依赖胞外多糖产出，但其上游偏好通讯的DGC尚未明确。本研究由研究人员开展，旨在阐明PA0290与PelD的功能关系。

主要技术方法概览：研究采用细菌腺苷酸环化酶双杂交（BACTH）筛选c-di-GMP相关互作蛋白，并以Ni2?亲和共纯化验证PA0290与PelD胞质区关联；通过静态结晶紫微孔板与流动腔共聚焦激光扫描显微镜定量生物被膜量；以逆转相HPLC用GTP底物检测纯化PA0290的DGC产物；利用cdrA-lux报告基因监测批量c-di-GMP应答转录；临床样本来自浙江大学医学院附属第一医院2018–2023年存档35株非重复铜绿假单胞菌临床分离株，结合刚果红菌落形态、结晶紫生物被膜定量及qRT-PCR检测PA0290/pelD转录，并用Spearman相关分析。

研究结果：

3.1 PA0290编码推定感觉型DGC但不独立调控生物被膜：生物信息学显示PA0290含N端PAS-PAC感觉域与C端GGDEF（GGEEF基序）。构建ΔPA0290、回补与过表达株，静态结晶紫显示删、补、过表达均相对野生型PAO1/EV无统计显著差异，提示单独改变PA0290丰度不给出可检出表型，需考察特定互作伙伴。

3.2 BACTH筛选鉴定PelD为PA0290候选互作伙伴：以PA0290为饵筛选43个c-di-GMP代谢/信号蛋白，7个超阈值（含PelD/PA3061）。β-半乳糖苷酶定量与双向T18/T25融合BACTH均示PA0290–PelD强信号；Ni2?亲和共纯化中His-PA0290共表达Pull-down洗脱液出现PelD^cyto预期条带而单表达对照无，支持两者胞质区关联。

3.3 PA0290协同PelD促进静态与流动条件生物被膜：PAO1单表达PA0290或pelD变化有限，共表达PA0290+PelD在16 h与24 h静态结晶紫OD₅₉₀/OD₆₀₀显著升高；流动腔SYTO 9染色经Imaris三维重建，共表达株生物量较所有对照（含单表达）大幅上升，证明伙伴共现方显强表型。

3.4 PA0290–PelD共表达不伴批量c-di-GMP应答报告基因持续激活：转入cdrA-lux，以ΔismP/p-imcA高c-di-GMP株为正对照（4 h峰及全程偏高），PAO1/EV、ΔPA0290/EV、单/共表达株时间曲线相近；0–24 h AUC分析共表达株相对PAO1/EV调整p=0.9400，无统计升高。表明该表型未引起批量c-di-GMP应答转录普遍上调，契合局部信号特征但未直接证明空间限制传递。

3.5 保守GGEEF基序贡献PA0290活性及共表达增强：构建PA0290^GGAAF，纯化后体外GTP反应HPLC示野生型出与标准c-di-GMP同保留时间产物峰，热灭活及GGAAF突变峰消失或锐减；静态生物被膜中PelD+PA0290^GGAAF共表达较PelD+野生PA0290增强幅度大减。提示完整GGEEF对产物形成及伙伴依赖生物被膜表型重要，但突变也可能影响稳定性/构象/互作，非单纯催化丧失证明。

3.6 临床分离株探索性分析示生物被膜与PA0290/pelD表达正相关：35株刚果红形态多样；结晶紫生物被膜量异质；qRT-PCR（rpoD归一）热图示两基因转录变异大。Spearman相关生物被膜vs PA0290 ρ=0.882（Holm调p<0.0001）、vs pelD ρ=0.856（Holm调p<0.0001）。未做MLST/WGS，相关非因果，仅作PAO1模型探索支持。

讨论浓缩：研究将PA0290由“保守GGDEF蛋白”推进至链接PelD与定义生物被膜输出。伙伴依赖性符合该菌DGC条件功能与DgcP-FimV等先例。cdrA-lux无持续激活合局部信号框架（输出特异+物理关联+全局池少扰），但未证空间限制核苷酸转移；RoeA研究提示特异输出亦可来自扩散c-di-GMP被受体层级解读。PA0290 PAS-PAC暗示环境配体（如SiaC-SiaD、IsmP-ImcA铁感、YfiN过氧化、嘌呤重编程）可能调节。PelD具退化GGDEF样受体区、属PelDEFG内膜合成复合体，BifA–PelD先例示酶–PelD耦合可不升全局c-di-GMP；但本研究未证共表达表型经Pel产出介导，需Δpel背景验证。直接耦合可经招募/捕获新合c-di-GMP/变构实现，类比LapD-DGC、DibA-LapD、ProE-PqsE。Eilers等曾报ΔPA0290降细胞c-di-GMP并损蘑菇结构，与本静态无表型互补示条件依赖。GGAAF解释须谨慎。临床相关为探索性。

结论翻译：综上，结果支持PA0290的二鸟苷酸环化酶活性及PA0290与PelD在生物被膜调控中的功能关联。PA0290与PelD共表达显著增强生物被膜形成，而保守GGEEF基序破坏削弱该表型。这些发现为未来研究PA0290–PelD关联如何贡献生物被膜调控提供依据。论文发表于《Microorganisms》。