整合蛋白质组学与代谢组学揭示非小细胞肺癌细胞中代谢重编程的关键分子MAT2A

《iScience》：Integrating proteomics and metabolomics to reveal MAT2A for metabolic reprogramming in non-small cell lung cancer cells

　　

要点
• MAT2A在NSCLC中高表达，且对肿瘤生长至关重要
• 蛋白质组学和代谢组学分析揭示了MAT2A驱动的代谢重编程
• MAT2A主要调控脂质代谢、糖酵解和转硫途径
• 同时靶向MAT2A和LXR可破坏胆固醇代谢，从而产生最高的协同效应

摘要
蛋氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）通过产生S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将代谢重编程与表观遗传调控联系起来，但其在非小细胞肺癌（NSCLC）中的作用尚不清楚，且现有抑制剂需要联合策略。我们使用蛋白质组学和代谢组学，对经MAT2A靶向siRNA或抑制剂AG-270处理的NSCLC细胞进行了分析，以表征MAT2A驱动的代谢重编程。在脂肪酸生物合成方面，MAT2A调控FASN和SCD；外源性棕榈酸可逆转AG-270诱导的生长抑制，支持其与FASN抑制剂TVB-2640联合使用。在胆固醇代谢方面，MAT2A调控胆固醇的合成和外流，而一种促进胆固醇外流的LXR激动剂可增强AG-270的疗效。在能量代谢方面，MAT2A通过HIF1A调控糖酵解，GLUT1抑制剂与AG-270具有协同效应。在转硫途径方面，MAT2A在转录水平调控CBS，并与PHGDH（生产用于半胱氨酸生物合成的丝氨酸）和SLC7A11（介导半胱氨酸摄取）的抑制剂表现出协同效应。总之，我们的发现确立了MAT2A在NSCLC中作为核心代谢调控因子的地位，并提出了合理的联合治疗策略。

图解摘要

引言
肺癌是全球主要的恶性肿瘤，与吸烟、遗传、辐射和慢性肺部疾病有关。2025年癌症统计报告显示，肺癌的发病率/100,000和死亡率/100,000，五年生存率为27%。非小细胞肺癌（NSCLC）约占病例数的85%，转移性NSCLC的中位总生存期不足三年。靶向治疗（主要针对EGFR、ALK、RET、BRAF、ROS1、NTRK、MET、KRAS和HER2）和免疫治疗（主要依据PD-1/PD-L1表达指导）的出现，显著改善了临床预后。然而，药物耐药性、可操作靶点有限以及治疗相关毒性仍然是主要挑战。这些局限性凸显了识别新的治疗靶点和优化联合治疗策略的迫切需要，以改善NSCLC的预后。

代谢重编程是癌症的特征之一，可通过表观遗传调控进行调节，使肿瘤细胞将生物合成和生物能量代谢通路（包括脂质、氨基酸和葡萄糖代谢）重定向以支持不受控制的增殖。蛋氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）是蛋氨酸（Met）循环中的关键酶，在多种癌症（包括肝细胞癌、结直肠癌和胃癌）中高表达，其中发挥促肿瘤作用。其代谢产物S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是DNA、RNA和组蛋白甲基化的主要甲基供体，有助于表观遗传调控，而表观遗传调控与代谢重编程密切相关。然而，关于MAT2A在NSCLC中的研究仍然有限，现有报告主要涉及肿瘤细胞干性维持等功能，而其在代谢重编程中的调控作用仍有待深入探索。

当前的MAT2A抑制剂（包括AG-270、SCR-7952和PF-9366）面临代谢可塑性的挑战，表现为MAT2A的代偿性上调，从而降低疗效。为克服这一局限性，正在探索两种策略。首先，肿瘤特异性脆弱性，如癌症中的MTAP缺失、胶质瘤中的H3K27M突变和前列腺癌中的ERG融合，增加了肿瘤对MAT2A的依赖性，这可被用于治疗。其次，合理的联合治疗方案已得到开发，例如在肝细胞癌（HCC）中同时抑制MAT2A和GSK3、在MTAP缺失肿瘤中同时抑制MAT2A和PRMT5，以及在白血病中将MAT2A抑制剂与地塞米松联合使用。这些联合策略在很大程度上局限于特定的肿瘤类型，而利用肿瘤代谢脆弱性的方法仍较少被探索。因此，在NSCLC中进一步研究基于MAT2A的联合治疗是值得的。

基于此背景，我们使用定量蛋白质组学和非靶向代谢组学，研究了MAT2A敲低或使用抑制剂AG-270处理后NSCLC中MAT2A驱动的代谢重编程。我们的分析揭示了MAT2A在脂质代谢、糖酵解和转硫途径中潜在的调控作用。此外，我们鉴定了候选联合治疗策略，包括AG-270与肝脏X受体（LXR）激动剂LXR-623联合治疗，显示出最高的协同评分。

结果
MAT2A在NSCLC中高表达，且对肿瘤生长至关重要

为验证MAT2A在NSCLC中的关键作用，我们对15例临床NSCLC样本进行了免疫组化（IHC）分析，结果显示与正常对照相比，肿瘤组织中的MAT2A表达显著升高（图1A和1B）。DepMap数据库的数据（包括shRNA敲低和CRISPR敲除数据集）显示，NSCLC细胞系对MAT2A表现出强烈的依赖性，如负依赖性评分所示（图S1A）。为在功能上验证这些发现，我们对NSCLC细胞系（H1299、H1975、Calu1）进行了三种不同的干预：siRNA介导的MAT2A敲低（siMAT2A）、MAT2A抑制剂AG-270和蛋氨酸剥夺。MAT2A敲低和蛋氨酸剥夺均显著抑制细胞增殖（图1C–1F和S1B–S1D），MAT2A抑制和敲低均显著诱导细胞凋亡（图1G、S1E和S1F）。这些结果表明MAT2A对肿瘤生长至关重要。值得注意的是，与先前研究一致，AG-270处理在mRNA和蛋白质水平均触发了MAT2A的代偿性上调（图S1G），凸显了需要联合策略以实现持续疗效。

图1 MAT2A在NSCLC中高表达，且对肿瘤生长至关重要

（A）显示人NSCLC组织和配对正常邻近组织（NATs）中MAT2A染色的代表性IHC图像。标尺，50 μm。
（B）15对配对人NSCLC组织和NATs中MAT2A表达的定量IHC分析。
（C–E）基于MAT2A siRNA敲低的H1299的敲低效应western blot分析（C）、细胞活力分析（n = 4）（D）和结晶紫染色结果（E）。Western blot分析中使用GAPDH作为上样对照。
（F）基于蛋氨酸剥夺的H1299细胞活力分析（n = 3）。
（G）10 μM AG-270处理H1299 48小时的凋亡率（n = 3）。

数据以均值±标准差表示（D、F和G）；统计显著性由双因素方差分析（D）和双尾Student's t检验（B、F–G）确定，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。实验独立重复三次（C–F）。另见图S1。

蛋白质组学和代谢组学分析揭示了H1299细胞中MAT2A驱动的代谢重编程模式

我们对经siMAT2A或MAT2A抑制剂AG-270处理的H1299细胞进行了定量蛋白质组学和非靶向代谢组学分析，以研究MAT2A在NSCLC肿瘤代谢中的作用（图S2A）。在蛋白质组学数据中，主成分分析（PCA）显示siMAT2A/AG-270组与对照组之间存在明显分离（图S2B和S2C），表明MAT2A敲低或抑制在肿瘤细胞中诱导了广泛的蛋白质组变化。具体而言，siMAT2A处理导致138个蛋白上调和155个蛋白下调，而AG-270处理导致59个蛋白上调和67个蛋白下调（FDR < 0.05，FC > 1.5或< 0.67）（图2A和2D）。非靶向代谢组学进一步支持MAT2A敲低扰动了部分肿瘤代谢。结合正负离子模式的数据，222个代谢物上调，195个代谢物下调（p < 0.05，FC > 1.5或< 0.67，VIP > 1）（图2G–2H、S2D和S2E）。差异表达蛋白和差异代谢物的富集分析进一步揭示，MAT2A敲低和抑制后多条代谢通路发生了改变。在蛋白质组学数据中，siMAT2A组和AG-270组均表现出脂质代谢和MAT2A相关碳代谢的显著下调，而AG-270组表现出糖酵解的显著下调和丝氨酸代谢的上调（图2B、2C、2E和2F）。在非靶向代谢组学数据中，京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析鉴定出在包括不饱和脂肪酸生物合成、脂质代谢以及半胱氨酸和Met代谢在内的通路中显著富集（图2I），这与蛋白质组学数据一致。

图2 蛋白质组学和代谢组学分析揭示了H1299细胞中MAT2A驱动的代谢重编程模式

（A）蛋白质组学中siMAT2A-1组的火山图（FDR < 0.05，FC > 1.5或< 0.67，双尾Student's t检验，BH校正）。
（B）siMAT2A-1组中差异表达蛋白的GOBP富集分析。
（C）siMAT2A-1组中差异表达蛋白的KEGG富集分析。
（D）蛋白质组学中AG-270组的火山图（FDR < 0.05，FC > 1.5或< 0.67，双尾Student's t检验，BH校正）。
（E）AG-270组中差异表达蛋白的GOBP富集分析。
（F）AG-270组中差异表达蛋白的KEGG富集分析。
（G和H）非靶向代谢组学中正离子代谢组（G）和负离子代谢组（H）中siMAT2A-1组的火山图（p < 0.05，FC > 1.5或< 0.67，VIP > 1，双尾Student's t检验）。
（I）非靶向代谢组学差异代谢物的KEGG富集。
（J）代谢网络展示了siMAT2A-1和AG-270组蛋白质组学中的三条主要通路，包括脂质代谢、能量代谢和MAT2A相关代谢；所有基因集均来源于KEGG数据库。网络中显示的蛋白具有显著性（p < 0.05，FC < 0.83或FC > 1.2，双尾Student's t检验）。代谢网络图使用Cytoscape（版本3.9.1）绘制。另见图S2。

为系统分析siMAT2A和AG-270蛋白质组学中显著且一致的改变，我们将显著差异表达蛋白与KEGG通路数据集中与脂质代谢、能量代谢和MAT2A相关代谢相关的内容进行了整合（图2J）。在脂质代谢中，参与脂肪酸生物合成（如SCD、FASN）和类固醇生物合成（如DHCR7、FDFT1）的蛋白普遍下调。在能量代谢中，糖酵解蛋白在两种处理中均普遍下调。TCA循环中的五个蛋白出现显著变化，多个与氧化磷酸化（OXPHOS）相关的蛋白表现出相反趋势，在AG-270组中下调，但在siMAT2A组中上调。在MAT2A相关代谢中，siMAT2A和AG-270处理也产生了不同的趋势。在siMAT2A组中，多个参与半胱氨酸和Met代谢的蛋白显著下调，而多个与叶酸代谢相关的蛋白显示出潜在的上调趋势。相比之下，AG-270组表现出半胱氨酸和Met代谢（如MAT2A、PSAT1和PHGDH）以及叶酸途径的一碳池（如MTHFD2、MTHFD1L和SHMT2）中多个蛋白的上调。

总之，MAT2A对肿瘤代谢施加了广泛的调控影响。其中，我们重点关注在siMAT2A和AG-270组中均表现出一致改变的几种代谢过程，包括脂肪酸生物合成、胆固醇（CHOL）代谢和糖酵解，以下内容将对此进行详细探讨。

MAT2A通过脂肪酸生物合成促进细胞增殖

脂质代谢的重编程在肿瘤中被广泛报道，包括脂肪酸（FA）生物合成的增加。基于KEGG中的脂肪酸生物合成基因集，蛋白质组学分析显示，H1299细胞中siMAT2A和AG-270组均表现出多个关键蛋白的变化，特别是ACSL4、FASN、FADS1和SCD的显著下调（图3A和S3A）。这些结果与其他NSCLC细胞系的蛋白质组学数据一致（图S3B）。基因集富集分析（GSEA）显示，siMAT2A和AG-270组中脂肪酸代谢均显著下调（图3B）。Western blot确认了MAT2A敲低和抑制后FASN和SCD蛋白水平的下降（图3C和S3C）。此外，MAT2A敲低后FASN和SCD的主要产物棕榈酸（PA）和油酸（OA）减少（图3D），提示MAT2A可能通过MAT2A-FASN/SCD-PA/OA轴调控脂肪酸生物合成。为阐明MAT2A对这些基因的调控机制，我们证明FASN和SCD均表现出mRNA水平降低及其启动子区域染色质可及性下降（图3E–3G），提示MAT2A可能通过转录调控FASN和SCD。

图3 MAT2A通过脂肪酸生物合成促进细胞增殖

（A）H1299经siMAT2A-1或5 μM AG-270处理后，KEGG中脂肪酸生物合成和不饱和脂肪酸生物合成基因集中显著蛋白的热图；p < 0.05（双尾Student's t检验），且FC < 0.83或FC > 1.2的蛋白视为显著。
（B）H1299经siMAT2A-1或5 μM AG-270处理后蛋白质组学数据中脂肪酸代谢的GSEA分析。
（C）H1299经siMAT2A-1或5 μM AG-270处理后FASN和SCD的Western blot分析。β-Actin用作上样对照。
（D）H1299经siMAT2A-1处理后棕榈酸（PA）和油酸（OA）水平的非靶向代谢组学分析（n = 6）。
（E）H1299经siMAT2A-1或5 μM AG-270处理后FASN和SCD的qPCR分析（n = 3）。
（F和G）H1299经siMAT2A-1处理后FASN（F）和SCD（G）的ATAC-seq分析（n = 2）。

图谱使用 IGV 软件 (版本 2.19.2) 生成。(H 和 I) 用不同浓度的 AG-270 和 2.5 μM PA 处理的 H1299 的相对细胞活力 (H)，以及 5 μM AG-270 和 2.5 μM PA 组合处理的代表性结果 (I) (n = 3)。(J) 用 1.5 μM AG-270 和 2.5 μM PA 处理的 H1299 的结晶紫染色结果 (n = 3)。(K) 用 AG-270 和 TVB-2640 处理的 H1299 的组合结果，显示 HSA 得分为 22.93，表明强协同效应 (n = 3)。数据以均值 ± 标准差表示 (E–K)；统计显著性由双尾学生 t 检验 (D–G) 或单因素方差分析 (I-K) 或双因素方差分析 (H) 确定，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。使用 SynergyFinder plus 进行药物组合结果分析 (K)。实验独立重复三次 (C, E, H-K)。另见图 S3。为了测试我们的假设，即 MAT2A 通过调节脂肪酸 (FA) 生物合成影响细胞增殖，我们在补充或不补充外源 PA 的情况下，用 AG-270 或 siMAT2A 处理 H1299 细胞。我们发现 PA 补充显著挽救了 AG-270 破坏的细胞活力，并在 siMAT2A 组中轻度挽救了细胞活力 (图 3H–3J 和 S3D–S3F)，支持了这一假设。为了进一步探索潜在的联合策略，我们评估了 AG-270 与 TVB-2640（一种临床研究的 FASN 抑制剂）联合使用的协同效应。在 H1299 和 H1975 细胞系中进行了联合处理实验，并使用最高单药 (HSA) 方法评估协同效应。在两种细胞系中，组合产生的 HSA 得分均大于 10 (图 3K 和 S3G)，表明存在显著的协同效应。综上所述，这些结果表明 MAT2A 部分通过调节 FA 生物合成促进细胞增殖，主要通过 FASN 和 SCD 的转录调节，且靶向 MAT2A 与 FASN 抑制剂表现出协同效应。

MAT2A 调节胆固醇稳态并与 LXR 激动剂协同
除了 FA 生物合成外，脂质代谢，特别是胆固醇 (CHOL) 代谢，在肿瘤进展中至关重要。H1299 细胞的蛋白质组学数据显示，HALLMARK 中胆固醇稳态基因集的大部分蛋白下调，GSEA 分析确认 siMAT2A 组和 AG-270 组中该通路受到显著抑制 (图 4A 和 4B)。在额外的 NSCLC 细胞系中也观察到类似结果 (图 S4A)。非靶向代谢组学显示 siMAT2A 组中 CHOL 及其衍生物呈下降趋势，包括 24(S),25-环氧化胆固醇 (24(S),25-EC) 和 7alpha,27-二羟基胆固醇 (7α,27-DHC) (图 4C)，表明 MAT2A 参与 CHOL 稳态。
图 4 MAT2A 调节胆固醇稳态并与 LXR 激动剂协同
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(A) H1299 中 siMAT2A-1 或 5 μM AG-270 蛋白质组学数据中 HALLMARK 胆固醇稳态基因集的热图；p < 0.05 (双尾学生 t 检验)，且 FC < 0.83 或 FC > 1.2 的蛋白被认为具有显著性。(B) H1299 中 siMAT2A-1 或 5 μM AG-270 蛋白质组学数据中胆固醇稳态的 GSEA 分析。(C) H1299 中 siMAT2A-1 条件下胆固醇 (CHOL)、24(S),25-环氧化胆固醇 (24(S),25-EC) 和 7alpha,27-二羟基胆固醇 (7α,27-DHC) 水平的非靶向代谢组学分析 (n = 6)。(D) H1299 中 siMAT2A-1 条件下胆固醇生物合成代谢物水平的靶向 LC-MS/MS 分析，包括羊毛甾醇 (LANO)、7-脱氢胆固醇 (7-DHC) 和胆固醇 (CHOL) (n = 3)。(E) H1299 中 siMAT2A-1 或 5 μM AG-270 条件下 HMGCS1、FDFT1 和 SQLE 的 Western 印迹分析。HMGCS1 免疫印迹使用 β-Actin 作为上样对照，FDFT1 和 SQLE 免疫印迹使用 GAPDH 作为上样对照。(F) H1299 中 siMAT2A-1 或 5 μM AG-270 条件下 HMGCS1、FDFT1、SQLE、HSD17B7 和 DHCR7 的 qPCR 分析 (n = 3)。(G) H1299 中 siMAT2A-1 条件下 DHCR7 的 ATAC-seq 分析 (n = 2)。图谱使用 IGV 软件 (版本 2.19.2) 生成。(H) H1299 中 siMAT2A-1 或 5 μM AG-270 条件下 ABCA1 的 Western 印迹分析。使用 β-Actin 作为上样对照。(I) 使用蛋白质组学数据描述胆固醇代谢通路；p < 0.05 (双尾学生 t 检验) 的蛋白被认为具有显著性。缩写：乙酰辅酶 A，Ac-CoA；乙酰乙酰辅酶 A，AcAc-CoA；β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶 A，HMG-CoA；异戊烯基焦磷酸，IPP；法尼基焦磷酸，FPP；角鲨烯，SQ；胆固醇酯，CE；低密度脂蛋白，LDL。(J) 用 AG-270 和 LXR-623 处理的 H1299 的组合结果，显示 HSA 得分为 34.7，表明强协同效应 (n = 3)。数据以均值 ± 标准差表示 (D, F, G 和 J)；统计显著性由双尾学生 t 检验 (C, D, F, 和 G) 和单因素方差分析 (J) 确定，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。使用 SynergyFinder plus 进行药物组合结果分析 (J)。实验独立重复三次 (E-F, H, J)，并独立重复两次 (D)。另见图 S4。
由于胆固醇稳态包括胆固醇合成、摄取和流出，我们首先研究了 MAT2A 对胆固醇合成的影响。进行靶向 LC-MS/MS 以确认 siMAT2A 组中几种胆固醇合成代谢物水平的降低，包括羊毛甾醇 (LANO)、7-脱氢胆固醇 (7-DHC) 和 CHOL，表明胆固醇合成受损 (图 4D)。此外，通过 Western 印迹验证了 MAT2A 敲低和抑制下胆固醇合成蛋白的下调，如 HMGCS1、FDFT1 和 SQLE (图 4E 和 S4B)。qPCR 分析支持了 MAT2A 对 HMGCS1、FDFT1 和 DHCR7 等基因潜在的转录调节 (图 4F)，并且 ATAC-seq 结果显示 DHCR7 的启动子区域染色质可及性降低 (图 4G)。综上所述，这些发现表明 MAT2A 可能调节胆固醇合成。为了研究 MAT2A 对胆固醇摄取和流出的影响，我们发现胆固醇摄取转运体 LDLR 下调 (图 4I 和 S4A)，表明胆固醇摄取受损。值得注意的是，MAT2A 敲低和抑制均下调了胆固醇流出转运体 ABCA1 (图 4H 和 S4C)，这可能抵消了胆固醇合成和摄取减少的影响。鉴于 AG-270 破坏胆固醇稳态，且有效的胆固醇靶向通常需要联合疗法，我们假设 AG-270 与促进胆固醇流出的 LXR 激动剂联合使用，可能通过加剧胆固醇失衡进一步破坏细胞增殖 (图 4I)。为了验证这一点，我们用 AG-270 和 LXR 激动剂 LXR-623 联合处理细胞，在 H1299、H1975、A549 和 H460 细胞系中观察到强协同效应 (HSA >10) (图 4J 和 S4D–S4F)。为了交叉验证协同效应，我们测试了额外的 MAT2A 抑制剂 PF-9366 和 SCR-7952，两者均表现出与 LXR-623 的显著协同性 (图 S4G)。总体而言，MAT2A 在 NSCLC 中重编程胆固醇稳态，其抑制剂与胆固醇流出激动剂 LXR-623 联合时表现出组合潜力。

MAT2A 通过 HIF1A 调节糖酵解并与 GLUT1 抑制剂协同
能量代谢的主要目标是产生 ATP，涉及脂肪酸氧化、谷氨酰胺解糖、糖酵解和氧化磷酸化 (OXPHOS) 等途径。葡萄糖代谢提供约 50%–70% 的总能量供应，超过脂肪酸代谢 (30%–50%) 和其他途径，凸显了其主导地位 (图 S5A)。我们的蛋白质组学数据显示 siMAT2A 和 AG-270 组中糖酵解酶失调 (图 2J)。因此，我们研究了 MAT2A 对糖酵解的影响。在 H1299、H1975 和 H460 细胞系中敲低或抑制 MAT2A 导致关键糖酵解蛋白下调，包括 PGK1、ALDOC、LDHA 和 HK2，而在 A549 细胞系中该效应不显著 (图 5A 和 S5B)。GSEA 分析进一步确认 MAT2A 的敲低和抑制均损害糖酵解 (图 5B)。非靶向代谢组学显示糖酵解中间体甘油醛 -3-磷酸 (GAP) 显著减少 (图 5C)，Seahorse 实验证实了 H1299 细胞中外排酸化率 (ECAR) 的降低 (图 5D 和 5E)。这些发现表明 MAT2A 敲低或抑制破坏糖酵解稳态 (图 5M)。在机制上，MAT2A 敲低、抑制和甲硫氨酸剥夺导致糖酵解基因 mRNA 水平降低 (图 5F 和 S5C)，其中 ATAC-seq 结果显示 LDHA 的启动子区域染色质可及性降低 (图 S5D)，提示潜在的转录调节作用。在关键糖酵解转录因子 HIF1A 和 c-Myc 之间，仅 HIF1A 蛋白水平在 MAT2A 敲低、MAT2A 抑制或甲硫氨酸剥夺后显著降低，而 c-Myc 未受影响 (图 5G 和 S5E)。KEGG 分析显示 HIF-1 信号通路下调 (图 2C 和 2F)，GSEA 分析突出了 MAT2A 敲低和 MAT2A 抑制细胞中缺氧信号通路（依赖 HIF1A）的抑制 (图 5H 和 S5F)。HIF1A 的敲低模拟了糖酵解基因表达的抑制表型 (图 5I 和 5J, S5G 和 S5H)。这些结果表明 MAT2A 通过 HIF1A 调节糖酵解。此外，MAT2A 敲低导致几个 HIF1A 靶基因下调。siMAT2A 组中 HIF1A 靶标蛋白水平降低，包括 SERPINE1、PIK3R1、PLOD2 和 CDKN1A，这与 Western 印迹、qPCR 和 ATAC-seq 的结果一致 (图 S5I–S5L)，进一步证实了 HIF1A 介导的转录沉默。此外，发现 MAT2A 敲低和抑制均降低了 HIF1A 的 mRNA 水平 (图 5K)，表明 MAT2A 可能在转录水平上调节 HIF1A 表达。综上所述，这些结果表明 MAT2A 在 NSCLC 中通过 HIF1A 的转录调节调节糖酵解 (图 5M)。
图 5 MAT2A 通过 HIF1A 调节糖酵解并与 GLUT1 抑制剂协同
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(A) KEGG 中糖酵解/糖异生基因集的热图，其中 H1299 中 siMAT2A-1 或 5 μM AG-270 蛋白质组学数据中的蛋白具有显著性；p < 0.05 (双尾学生 t 检验)，且 FC < 0.83 或 FC > 1.2 的蛋白被认为具有显著性。(B) H1299 中 siMAT2A-1 或 5 μM AG-270 蛋白质组学数据中糖酵解的 GSEA 分析。(C) H1299 中 siMAT2A-1 条件下甘油醛 -3-磷酸 (GAP) 水平的非靶向代谢组学分析 (n = 6)。(D 和 E) Seahorse 实验检测 H1299 中 siMAT2A-1 (n = 3) (D) 和 AG-270 (n = 3) (E) 的糖酵解能力。实验在生物学三重重复中进行。(F) H1299 中 siMAT2A-1、5 μM AG-270 或甲硫氨酸剥夺条件下糖酵解相关基因的 qPCR 分析，包括 PGM1、LDHA、ENO1、HK2、PGK1 和 GPI (n = 4)。(G) H1299 中 siMAT2A-1、5 μM AG-270 或甲硫氨酸剥夺条件下 HIF1A 的 Western 印迹分析。使用 β-Actin 作为上样对照。(H) H1299 中 siMAT2A-1 或 5 μM AG-270 蛋白质组学数据中缺氧的 GSEA 分析。(I) H1299 中 siHIF1A 条件下 HIF1A 的 Western 印迹分析。使用 β-Actin 作为上样对照。(J) H1299 中 siHIF1A 条件下糖酵解相关基因的 qPCR 分析，包括 PGM1、LDHA、ENO1、HK2、PGK1 和 GPI (n = 3)。(K) H1299 中 siMAT2A-1 或 AG-270 条件下 HIF1A 的 qPCR 分析 (n = 4)。(L) 用 AG-270 和 BAY-876 处理的 H1299 的组合结果，显示 HSA 得分为 19.7，表明协同效应 (n = 3)。(M) 蛋白质组学中蛋白变化的糖酵解通路，p < 0.05 (双尾学生 t 检验) 的蛋白被认为具有显著性。缩写：葡萄糖，Glc；葡萄糖 -6-磷酸，G6P；葡萄糖 -1-磷酸，G1P；果糖 -6-磷酸，F6P；果糖 -2,6-二磷酸，F2,6BP；果糖 -1,6-二磷酸，F1,6BP；1,3-二磷酸甘油酸，1,3-BPG；2,3-二磷酸甘油酸，2,3-BPG；3-磷酸甘油酸，3-PG；2-磷酸甘油酸，2-PG；磷酸烯醇式丙酮酸，PEP；丙酮酸，Pyr；乳酸，Lac。数据以均值 ± 标准差表示 (D–F, J–L)，统计显著性由双尾学生 t 检验 (C–F, J–K)，单因素方差分析 (L)，和双因素方差分析 (D-E) 确定，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。使用 SynergyFinder plus 进行药物组合结果分析 (L)。实验独立重复三次 (F, G, I 和 J–L)。另见图 S5。
接下来，我们探索了同时靶向 MAT2A 和糖酵解的联合策略。有氧糖酵解是癌症的公认特征，这促进了多种针对关键糖酵解调节因子（如 GLUT1、HK2 和 LDHA）的抑制剂的发展。其中，GLUT1 抑制剂（包括 BAY-876 和 STF-31）已在临床前模型中显示出抗肿瘤功效。然而，GLUT1 在正常组织中的广泛表达限制了其临床用途，凸显了联合疗法的潜力。基于此，我们假设 MAT2A 抑制（损害糖酵解）与 GLUT1 阻滞（限制葡萄糖摄取）联合使用，可能协同破坏能量代谢并诱导肿瘤细胞死亡。GLUT1 抑制剂 BAY-876 与 AG-270 联合处理在 H1299 和 H1975 细胞系中均产生了协同效应 (图 5L 和 S5M)，突显了 MAT2A 抑制作为增强 NSCLC 糖酵解靶向的有前景策略。
MAT2A 敲低影响 MAT2A 相关代谢通路
甲硫氨酸循环与多条代谢通路相关。一方面，产物 SAM 参与多胺合成，其副产物 5′-甲基硫腺苷 (MTA) 通过甲硫氨酸回收途径回收以再生甲硫氨酸。

另一方面，SAM作为表观遗传调控中关键的甲基供体，其下游代谢产物S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）参与转硫途径（图S6A）。在H1299细胞中，siMAT2A组的蛋白质组学分析揭示了半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路中蛋白水平的改变（图S6B）。基因集富集分析（GSEA）显示该通路显著下调（图S6C），其中包括与甲硫氨酸循环相关的蛋白（MAT2B、DNMT3A、DNMT3B）、多胺合成和甲硫氨酸回收通路相关的蛋白（SMS、ADI1），以及转硫途径相关的蛋白（CBS、CTH、GCLM）（图S6D）。除H1299细胞外，其他非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系经siMAT2A处理后也观察到类似的下调MAT2A相关代谢通路，包括H460细胞中转硫途径的下调，以及不同NSCLC细胞系中MAT2B（甲硫氨酸循环）和CBS（转硫途径）的一致降低（图S6E）。非靶向代谢组学显示甲硫氨酸循环中的关键代谢物显著下调，包括SAM和SAH，同型半胱氨酸（Hcy）也呈下降趋势，而由于MAT2A功能受损，Met水平显著上调（图S6F），表明甲硫氨酸循环严重紊乱。多胺合成通路的代谢物，如L-鸟氨酸（Orn）、N-乙酰腐胺（Ac-Put）和N1,N8-二乙酰亚精胺（DiAcSpd），明显保留，而终产物亚精胺（Spm）因代谢酶SMS的下调而显著减少（图S6D和S6G）。此外，多胺合成通路的副产物MTA及其下游代谢物5-甲基硫核糖-1-磷酸（MTR-1P，在甲硫氨酸回收通路中至关重要）也显著下调，进一步表明甲硫氨酸回收通路受损（图S6G）。总体而言，MAT2A深刻影响多胺合成、甲硫氨酸回收通路和转硫途径等相关代谢通路。

MAT2A通过CBS调控转硫途径，并与SLC7A11或PHGDH抑制剂产生协同效应

基于KEGG基因集——半胱氨酸和甲硫氨酸代谢，我们对H1299细胞中MAT2A敲低和抑制的蛋白质组学数据中下调的蛋白进行了重叠分析。转硫途径的关键酶CBS被鉴定为下调最显著的蛋白（图6A）。在其他NSCLC细胞系中也观察到类似现象（图6B），并通过Western blot在H1299和H1975细胞系中得到验证（图6C和S6H）。qPCR结果显示MAT2A敲低降低了CBS mRNA水平（图6D），表明MAT2A影响CBS的转录。此外，对CBS的直接产物胱硫醚（Cysta）及其邻近代谢物SAM和SAH进行靶向检测，发现在MAT2A敲低和抑制条件下均显著下调（图6E）。非靶向代谢组学显示转硫途径的产物谷胱甘肽在MAT2A敲低后呈下降趋势（图S6I）。这些结果表明MAT2A耗竭破坏了转硫途径。

图6 MAT2A通过CBS调控转硫途径，并与SLC7A11或PHGDH抑制剂产生协同效应

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(A) 基于蛋白质组学数据，H1299细胞中siMAT2A-1组和AG-270组在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路中下调蛋白的重叠维恩图。
(B) siMAT2A-1和AG-270处理的NSCLC细胞系中CBS强度的蛋白质组学数据分析。
(C) H1299细胞中siMAT2A-1和5 μM AG-270处理后的CBS Western blot分析。β-肌动蛋白作为上样对照。
(D) H1299细胞中siMAT2A-1处理的CBS qPCR分析（n = 4）。
(E) H1299细胞中siMAT2A-1或5 μM AG-270处理的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）、胱硫醚（Cysta）等代谢物水平的靶向LC-MS/MS分析（n = 3）。
(F) AG-270组中转硫途径和丝氨酸生物合成相关基因蛋白水平的蛋白质组学数据。
(G) 蛋白质组学中的MAT2A相关代谢及蛋白变化；p < 0.05（双侧Student's t检验）的蛋白被认为具有显著性。缩写：甲硫氨酸，Met；同型半胱氨酸，Hcy。
(H) AG-270与HG106联合处理H1299的结果，HSA评分 = 12.25，表明协同效应（n = 3）。
(I) AG-270与NCT-503联合处理H1299的结果，HSA评分 = 22.06，表明协同效应（n = 3）。

数据以均值±标准差（SD）表示（D、E、H和I）；统计学显著性通过双侧Student's t检验（D和E）或单因素方差分析（H-I）确定，?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。使用SynergyFinder plus进行联合用药结果分析（H和I）。实验独立重复三次（C、D、H和I）。另见图S6。

半胱氨酸是转硫途径中一种非必需氨基酸，参与谷胱甘肽和H?S的生物合成。它可以通过转硫途径内源性合成，也可以通过SLC7A11/SLC3A2转运系统直接摄取。值得注意的是，我们观察到MAT2A抑制显著上调这些转运蛋白（图6F和6G）。我们假设同时抑制转硫途径和半胱氨酸摄取可能协同降低胞内半胱氨酸可用性，从而损害肿瘤细胞活力。SLC7A11抑制剂HG106与MAT2A抑制剂AG-270联合可显著抑制NSCLC细胞系的增殖（图6H和S6J），突显了这种双重靶向策略的潜在治疗价值。

此外，MAT2A抑制导致丝氨酸生物合成相关蛋白显著上调，包括PHGDH和PSPH，这一现象在其他NSCLC细胞系（H1975、A549和H460）的siMAT2A处理后也一致观察到（图6F和6G以及S6K）。由于丝氨酸参与转硫途径和叶酸循环（图6G），我们假设同时抑制丝氨酸生物合成和甲硫氨酸循环可能产生协同治疗效果。因此，PHGDH抑制剂NCT-503与AG-270在NSCLC细胞系中的联合使用显著抑制了细胞增殖（图6I和S6L）。总之，MAT2A调控转硫途径中CBS的表达，并且与SLC7A11或PHGDH抑制剂在非小细胞肺癌中具有潜在的协同效应。

讨论

MAT2A已被鉴定为多种癌症中的关键靶点，包括肝细胞癌（HCC）、H3K27M突变型胶质瘤、MTAP缺陷肿瘤和ERG融合阳性前列腺癌。然而，MAT2A在非小细胞肺癌中的作用仍有待阐明，现有研究将MAT2A与肿瘤起始细胞（TICs）中的甲硫氨酸依赖等现象联系起来。在本研究中，我们证明MAT2A对NSCLC细胞生存至关重要，因为遗传敲低和药物抑制均显著抑制了增殖并诱导了凋亡。

在甲硫氨酸循环中，MAT2A催化SAM的合成，SAM是表观遗传调控的主要甲基供体，代表了一种代谢重编程的潜在机制。然而，MAT2A如何在非小细胞肺癌中调控肿瘤代谢仍有待阐明。在本研究中，siMAT2A或AG-270处理的NSCLC细胞系蛋白质组学和代谢组学揭示，MAT2A影响脂肪酸代谢、胆固醇稳态、糖酵解、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢。靶向肿瘤代谢常常受到适应性代谢重塑的阻碍。与先前的研究一致，我们的结果表明MAT2A抑制触发了MAT2A表达的代偿性上调。目前，MAT2A抑制剂主要应用于MTAP缺陷肿瘤，因为其合成致死机制明确，突显了有效联合策略的迫切需求。因此，我们研究了MAT2A对上述代谢通路的影响，并探索了潜在的治疗脆弱性。

脂质代谢重编程，包括脂肪酸和胆固醇生物合成、摄取和储存的增强，是胶质瘤、肺癌、乳腺癌和肝癌等多种癌症的特征。我们的研究鉴定出MAT2A在非小细胞肺癌中调控脂肪酸生物合成和胆固醇稳态。在脂肪酸代谢中，通过siMAT2A或AG-270抑制MAT2A导致FASN和SCD等关键脂合成基因启动子处表达降低和染色质可及性降低（图7A）。在其他NSCLC细胞系的蛋白质组学数据中也观察到类似发现（图S3B）。先前的研究表明FASN表达与H3K4me3甲基化相关，KMT5A抑制可降低SCD和FASN水平，表明MAT2A在表观遗传调控中的潜在作用。FASN和SCD的关键代谢物，包括棕榈酸（PA）和油酸（OA），在MAT2A敲低后也减少（图7A），而PA补充显著挽救了AG-270引起的细胞活力下降，表明MAT2A部分通过脂肪酸生物合成促进细胞生长。

图7 MAT2A调控肿瘤代谢，并提出潜在的联合策略

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(A、C和E) MAT2A调控脂质代谢，包括脂肪酸生物合成和胆固醇稳态（A）、能量代谢中的糖酵解（C），以及半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸代谢（E）。
(B、D和F) MAT2A抑制剂AG-270与FASN抑制剂TVB-2640、LXR激动剂LXR-623（B）、GLUT1抑制剂BAY-876（D）、PHGDH抑制剂NCT-503及SLC7A11抑制剂HG106（F）表现出潜在的联合效应。

缩写：丝氨酸，Ser；半胱氨酸，Cys。

脂质生物合成抑制剂，包括靶向FASN和SCD的抑制剂，已在肺癌、结直肠癌和乳腺癌等多种肿瘤类型中得到广泛研究。然而，靶向脂肪酸代谢中的单一酶往往疗效有限，将此类抑制剂与靶向代偿性或调控性通路的药物联合可能增强治疗效果。值得注意的是，FASN抑制剂TVB-2640（denifanstat）是一种强效、选择性且可口服的药物，已进入临床研究阶段，在早期临床试验中表现出良好的药代动力学特性、耐受性和有限的全身毒性。鉴于其增强其他治疗策略（如化疗或靶向治疗）疗效的能力，TVB-2640特别适合联合用药策略。基于这些考虑，我们测试了TVB-2640与AG-270的联合使用，并观察到潜在的协同效应（图7B）。

胆固醇稳态包含四个关键过程——生物合成、摄取、外排和酯化。在四种NSCLC细胞系的蛋白质组学分析中，MAT2A主要影响胆固醇生物合成和摄取（图7A和S4A）。具体而言，MAT2A敲低改变了胆固醇生物合成代谢物，如LANO、7-DHC和CHOL。先前的研究表明甲硫氨酸缺乏通过抑制转录因子SREBF2下调胶质瘤起始细胞中的胆固醇生物合成基因。与此一致，我们发现MAT2A通过调控DHCR7和HMGCS1等关键酶的mRNA水平来调控胆固醇生物合成基因，确认了其在转录调控中的作用。此外，MAT2A敲低和抑制均下调了ABCA1，即主要的胆固醇外排转运蛋白，表明胆固醇外排受到抑制。

基于这些发现，我们提出了一种潜在的双重靶向胆固醇输入和输出的联合治疗策略。我们观察到AG-270在有效破坏胆固醇生物合成和摄取的同时，也下调了ABCA1，这可能部分抵消其降低胆固醇的效果。因此，我们假设联合MAT2A抑制与ABCA1上调将协同耗竭细胞内胆固醇并增强细胞毒性。LXR激动剂，如LXR-623、T0901317和GW3965，是经典的通过上调ABCA1和下调LDLR促进胆固醇外排并减少摄取的化合物。尽管LXR-623进入了临床试验，但由于中枢神经系统（CNS）毒性而终止开发，目前临床上没有活跃的LXR激动剂，突显了需要替代策略（如新型化合物设计、靶向药物递送系统或联合治疗）来发挥其治疗潜力。在本研究中，我们测试了LXR-623与AG-270的联合使用，并观察到显著的协同效应（图7B）。为验证此联合策略的普适性，我们将分析扩展至多个NSCLC细胞系和不同的MAT2A抑制剂（PF-9366、SCR-7952），所有组合均与LXR-623表现出显著的协同活性。这些结果表明MAT2A抑制剂与LXR激动剂的联合是一种有前景的治疗策略，值得进一步研究。

瓦伯格效应是许多肿瘤的特征，表现为有氧糖酵解和乳酸产生，由上调的葡萄糖转运蛋白（GLUTs）和糖酵解酶（如HK2、PFK1和PKM2）驱动。在本研究中，我们鉴定出MAT2A调控H1299、H1975和H460细胞系中与糖酵解相关的蛋白水平（图7C和S5B）。在H1299细胞中，MAT2A敲低和抑制导致糖酵解能力降低，伴随LDHA等糖酵解基因mRNA水平的下降，表明转录调控。此外，我们发现经典糖酵解转录因子中HIF1A（而非c-Myc）在蛋白和mRNA水平均下调，进一步的siRNA实验验证了MAT2A通过调控HIF1A的转录影响糖酵解。Gen He的研究报道甲硫氨酸缺乏下调原代肌细胞中的糖酵解基因和HIF1A，与我们的发现一致。阻断葡萄糖摄取从而抑制糖酵解活性的GLUT1抑制剂，如STF-31和BAY-876，在临床前研究中显示出潜在的抗肿瘤效果。然而，由于GLUT1在正常组织中广泛表达，GLUT1抑制剂常受到选择性低、毒性高和副作用等限制。

这些挑战强调了需要采用联合策略来降低有效剂量并减轻毒性。在此背景下，我们评估了AG-270和BAY-876的联合效应，结果表明在NSCLC细胞系中表现出协同效应（图7D），支持了同时靶向MAT2A和糖酵解的潜力。有趣的是，在携带KRAS G12S突变的A549细胞中（表S1），蛋白质组学分析显示MAT2A对糖酵解没有显著影响（图S5B）。先前的研究表明，与H1299和H460细胞相比，A549细胞的基础糖酵解活性较低。此外，对携带KRAS G12S突变的结直肠癌细胞系SW48的研究显示其胞内外乳酸水平降低，表明该突变与糖酵解能力下降相关。这些研究表明A549细胞对内源性糖酵解的依赖性较低，这可能限制了MAT2A抑制对该通路的效应。

MAT2A相关的代谢通路在MAT2A敲低和抑制后受到损害。在甲硫氨酸循环中，MAT2A敲低下调了SAM和SAH水平，并增加了Met水平，表明该循环受到严重损害。在转硫途径中，MAT2A敲低和抑制下调了H1299细胞中关键酶CBS的蛋白水平，在其他细胞系中也观察到了类似现象（图6B），其直接产物Cysta水平下降的现象在H1299细胞中得到了验证（图7E）。MAT2A调控CBS的转录过程，这与先前研究结果一致，即在该研究中，在胚胎着床模型中，Met剥夺导致CBS mRNA下调。

值得注意的是，AG-270组显示出MAT2A相关代谢通路中可能上调的蛋白。一方面，AG-270显著上调了丝氨酸生物合成通路中的关键酶，如PSPH和PHGDH，在siMAT2A组中观察到了类似效应（图S6K）。丝氨酸是转硫途径所需的关键代谢物，作为胱硫醚形成的前体。基于这一原理，我们假设同时抑制上调的丝氨酸合成基因和影响转硫途径的MAT2A，可能产生协同效应。PHGDH是催化丝氨酸生物合成通路第一步限速步骤的关键靶点，可被包括NCT-503和CBR-5884在内的化合物抑制。NCT-503处于临床前阶段，具有较好的ADME特性，且不引起小鼠显著体重下降，表明其具有良好的安全性。它已在多种肿瘤类型（如胶质母细胞瘤和乳腺癌）中得到研究。尽管PHGDH抑制剂在多种癌症模型中表现出令人前景的抗肿瘤活性，但肿瘤细胞通常会激活替代通路并表现出代谢可塑性以降低治疗效果，这强调了需要靶向多个代谢节点的联合策略。据此，我们评估了AG-270和NCT-503的联合应用，在NSCLC细胞系中观察到显著的协同效应（图7F）。

另一方面，AG-270显著上调了转运体SLC7A11，该转运体将胱氨酸转运至细胞质中，从而通过转硫途径补充细胞内半胱氨酸水平。由于SLC7A11在促进肿瘤存活中的关键作用，已成为一个有前景的治疗靶点。作为SLC7A11的高效选择性抑制剂，HG106已被证实具有强大的抗肿瘤效果。重要的是，HG106表现出良好的安全性，在小鼠模型中以最小的系统毒性实现显著的肿瘤抑制。基于此，我们假设将HG106与AG-270联合使用将增强对转硫途径的抑制，从而提高细胞毒性。正如预期，该联合方案产生了显著的协同效应（图7F）。

综上所述，我们证明MAT2A对NSCLC细胞生长至关重要，并调控多种代谢通路，包括脂肪酸生物合成、CHOL稳态、糖酵解和转硫途径，突显了其在代谢重编程中的核心作用。基于整合组学分析，确定了多种与MAT2A抑制剂AG-270的潜在联合策略，包括FASN抑制剂TVB-2640、CHOL外排激动剂LXR-623、GLUT1抑制剂BAY-876、PHGDH抑制剂NCT-503和SLC7A11抑制剂HG106，其中LXR-623显示出最高的协同评分。

研究的局限性

本研究存在若干局限性。首先，机制研究主要聚焦于转录水平。进一步研究应阐明MAT2A如何通过组蛋白甲基化等表观遗传修饰调控代谢基因表达。其次，蛋白质组和代谢组学分析是使用NSCLC细胞系模型进行的，该模型无法重现肿瘤微环境（TME）。鉴于肿瘤代谢与TME之间的相互作用，未来研究应探讨MAT2A重塑的代谢如何影响TME。第三，联合策略的抗肿瘤效果是在NSCLC细胞系中评估的。需要额外的临床前模型来验证其治疗潜力。第四，尽管本研究确定了多种MAT2A调控的代谢通路，但它们之间的相互联系仍未得到充分探索。阐明这些代谢网络可能揭示更广泛的调控机制。最后，siRNA敲低与AG-270处理之间的差异需要进一步调查，这可能与MAT2A的非酶促功能、细胞适应或脱靶效应有关。

资源可用性

主要联系人

如需进一步信息和资源，请联系并获取主要联系人刘乾（[e-mail]）的答复。

材料可用性

本研究未产生新的独特试剂。

数据和代码可用性

• 质谱蛋白质组学数据已存于蛋白质组交流联盟（ProteomeXchange Consortium）的iProX合作伙伴仓库，iProX编号：PXD068220。ATAC-seq数据已存于基因表达综汇（GEO），GEO编号：GSE307556。代谢组学数据已存于美国国立卫生研究院共同基金的国家代谢组学数据仓库（NMDR）网站——代谢组学工作台，NMDR编号：PR002662。其他所有原始数据已存于Mendeley Data：https://doi.org/10.17632/fkbrcn84vz.4。所有数据在发表之日均已公开获取。登录号列于主要资源表中。

• 本文未报告原始代码。

• 重新分析本文报告数据所需的任何附加信息，均可向主要联系人索取。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号22425703和22507131）、上海市 Rising-Star 计划（扬帆专项）（编号24YF2755900）、中国科学院战略性先导科技专项（编号XDB0830000）、国家重点研发计划（编号2022YFA1302902）、上海市东方英才计划领军人才项目（编号LJ2023123）、上海市自然科学基金（25ZR1401308）、同济大学独立原创基础研究项目（编号22120240374）以及中国健康医疗发展基金会（医学研究项目，chmdf2024-xrzx02-21）的资助。

作者贡献

Y.C.设计了大部分实验并撰写了论文。Y.L.执行了大部分实验。Z.Z.协助完成了靶向代谢物检测。A.D.执行了ECAR实验。Y.S.修订了论文。X.W.和C.W.执行了ATAC-seq实验。Q.F.资助了本工作并执行了IHC实验。H.Z.和Q.L.资助并指导了本工作。

利益声明

作者声明不存在竞争利益。

STAR★方法

主要资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 抗体 | | |
| 兔多克隆抗MAT2A抗体（用于免疫组织化学染色） | Servicebio | Cat# GB114610 |
| 兔单克隆抗MAT2A抗体（用于Western blot） | ABclonal | Cat# A19272; RRID: AB_3094915 |
| 兔单克隆抗β-Actin抗体 | ABclonal | Cat# AC038; RRID: AB_2863784 |
| 兔多克隆抗HMGCS1抗体 | ABclonal | Cat# A3916; RRID: AB_2765382 |
| 兔多克隆抗SQLE抗体 | ABclonal | Cat# A2428; RRID: AB_2764343 |
| 兔单克隆抗FDFT1抗体 | ABclonal | Cat# A4651; RRID: AB_2863317 |
| 兔单克隆抗ABCA1抗体 | ABclonal | Cat# A22125 |
| 兔单克隆抗SCD抗体 | GenuIN BIOTECH | Cat# 5218 |
| 兔单克隆抗FASN抗体 | Selleck | Cat# F0225 |
| 兔单克隆抗HIF1A抗体 | HUABIO | Cat# HA721997; RRID: AB_3096587 |
| 兔单克隆抗MYC抗体 | HUABIO | Cat# HA721182; RRID: AB_3072302 |
| 兔单克隆抗CBS抗体 | HUABIO | Cat# ET7109-21; RRID: AB_3070911 |
| 兔单克隆抗CDKN1A抗体 | HUABIO | Cat# HA722685; RRID: AB_3676654 |
| 小鼠单克隆抗GAPDH抗体 | Abmart | Cat# M20006; RRID: AB_2737054 |
| 山羊抗兔抗体（用于免疫组织化学染色） | Servicebio | Cat# GB23303; RRID: AB_2811189 |
| 山羊抗兔抗体（用于Western blot） | Signalway Antibody | Cat# L3012; RRID: AB_895483 |
| 山羊抗鼠抗体（用于Western blot） | Signalway Antibody | Cat# L3032; RRID: AB_895481 |
| 生物样本 | | |
| 人NSCLC冷冻组织样本 | 上海市肺病医院（同济大学，上海，中国） | K24-537 |
| 化学试剂、多肽和重组蛋白 | | |
| 20× Tris-EDTA抗原修复液（pH 8.0） | Servicebio | Cat# G1206 |
| 3%过氧化氢 | ANNJET | N/A |
| 苏木素染色液 | Servicebio | Cat# G1004 |
| 苏木素分化液 | Servicebio | Cat# G1039 |
| 苏木素蓝化液 | Servicebio | Cat# G1040 |
| McCoy's 5A（改良）培养基 | Gibco | Cat# 16600082 |
| DMEM（高糖，无谷氨酰胺，无甲硫氨酸，无胱氨酸） | Gibco | Cat# 21013024 |
| XF糖酵解压力测试培养基 | Sigma-Aldrich | Cat# D5030 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | Cat# L4509 |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | Cat# D9163 |
| Tris | VWR chemicals | Cat# 0497 |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | Cat# U1250 |
| 碘乙酰胺 | Sigma-Aldrich | Cat# I6125 |
| 碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | Cat# 09830 |
| 测序级改良胰蛋白酶 | Promega | Cat# V5111 |
| 三氟乙酸 | Sigma-Aldrich | Cat# 8082600101 |
| 甲酸 | Merck | Cat# 5.33002.0050 |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | Cat# 695092 |
| LC-MS级水 | Fisher chemical | Cat# W6-4 |
| 乙腈 | Fisher chemical | Cat# A955-4 |
| 二氯甲烷 | Ourchem | Cat# 40071190 |
| 丁基羟基甲苯（BHT） | aladdin | Cat# D104365 |
| 甲醇 | Merck | Cat# 1.06007.4008 |
| 结晶紫 | Sinopharm Reagent | Cat# 71012314 |
| 牛血清白蛋白（用于Western blot和PA溶剂） | Sangon Biotech | Cat# A600332-0100 |
| TRIzol试剂 | invitrogen | Cat# 15596018 |
| CNDEPC处理水 | Beyotime | Cat# R0021 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | Cat# G7528 |
| 寡霉素A | Selleck | Cat# S14782 |
| DG | MedChemExpress | Cat# HY-13966 |
| Hoechst33342 | Invitrogen | Cat# H3570 |
| 碘化丙啶（PI） | Invitrogen | Cat# P3566 |
| L-甲硫氨酸 | Sigma-Aldrich | Cat# M5308 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | Cat# G8540 |
| L-胱氨酸 | Sigma-Aldrich | Cat# C7602 |
| 棕榈酸钠 | Sigma-Aldrich | Cat# P9767 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | Cat# D2650 |
| AG-270 | MedChemExpress | Cat# HY-138630 |
| TVB-2640 | MedChemExpress | Cat# HY-112829 |
| LXR-623 | MedChemExpress | Cat# HY-10629 |
| BAY-876 | MedChemExpress | Cat# HY-100017 |
| HG106 | MedChemExpress | Cat# HY-W451275 |
| NCT-503 | MedChemExpress | Cat# HY-101966 |
| 关键商业试剂盒 | | |
| DAB底物试剂盒 | Servicebio | Cat# G1212 |
| Lipofectamine 3000转染试剂盒 | Invitrogen | Cat# L3000015 |
| Hyperactive ATAC-Seq文库构建试剂盒（适用于Illumina） | Vazyme | Cat# TD711 |
| Cell Counting Kit-8 | Beyotime | Cat# C0039 |
| Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | Cat# 556547 |
| PrimeScript? RT试剂试剂盒（Perfect Real Time） | TAKARA | Cat# RR037A |
| THUNDERBIRD? SYBR? qPCR Mix试剂盒 | TOYOBO | Cat# QPS-201 |
| Super Signal West Pico化学发光底物 | Thermo Scientific | Cat# 34096 |
| 存档数据 | | |
| 蛋白质组学数据 | ProteomeXchange Consortium | iProX: PXD068220 |
| 代谢组学数据 | 美国NIH共同基金国家代谢组学数据仓库（NMDR）网站，Metabolomics Workbench | NMDR: PR002662 |
| ATAC-seq | 基因表达综汇（GEO） | GEO: GSE307556 |
| 原始数据 | 本文，Mendeley data | Mendeley Data: https://doi.org/10.17632/fkbrcn84vz.4 |
| 实验模型：细胞系 | | |
| NCI-H1299 | 中国科学院细胞库 | Cat# SCSP-589 |
| NCI-H1975 | 中国科学院细胞库 | N/A |
| NCI-H460 | 中国科学院细胞库 | N/A |
| A549 | 中国科学院细胞库 | N/A |
| Calu1 | 张乃霞实验室（中国科学院上海药物研究所） | N/A |
| 寡核苷酸 | | |
| 靶向人MAT2A的siRNA（siMAT2A-1）：5′-GGUUCGUGAAGCUGUUAAA-3′ | GENEWIZ（苏州，中国） | N/A |
| 靶向人MAT2A的siRNA（siMAT2A-2）：5′-GAGCAACAGUCACCAGAUA-3′ | GENEWIZ（苏州，中国） | N/A |
| 靶向人HIF1A的siRNA（siHIF1A-1）：5′-GUGAUGAAAGAAUUACCGAAU-3′ | GENEWIZ（苏州，中国） | N/A |
| 靶向人HIF1A的siRNA（siHIF1A-2）：5′-GGGAUUAACUCAGUUUGAACUAACU-3′ | GENEWIZ（苏州，中国） | N/A |
| 阴性对照siRNA（NC）：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′ | GENEWIZ（苏州，中国） | N/A |
| 软件和算法 | | |
| Aipathwell软件 | Servicebio | N/A |
| FlowJo软件（版本10.8.1） | FlowJo LLC. | https://www.flowjo.com/ |
| Thermo Xcalibur | Thermo Fisher Scientific | N/A |
| DIA-NN | Demichev等 | https://github.com/vdemichev/diann |
| R软件 | | https://www.r-project.org/ |
| clusterProfiler R包（版本4.16.0） | Yu等 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html |
| Cytoscape（版本3.9.1） | Cytoscape软件 | https://cytoscape.org/ |
| GraphPad Prism（版本9） | GraphPad Software | http://www.graphpad.com |
| ProteoWizard | Chambers等 | https://proteowizard.sourceforge.io/ |
| XCMS软件 | Smith等 | N/A |
| metaX | Wen等 | http://metax.genomics.cn/ |
| Bowtie2 | Langmead等 | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml |
| Picard MarkDuplicates工具 | GATK Team | https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360037052812-MarkDuplicates-Picard |
| deepTools（bamCoverage） | Ramírez等 | GitHub - gartician/deepTools-bamCoverage |
| IGV软件（版本2.19.2） | Robinson等 | https://igv.org/ |
| SynergyFinder Plus平台 | Synergyfinder网站 | https://synergyfinder.org/ |

实验模型和研究参与者详情

人类参与者

来自15例中国患者的配对NSCLC冷冻组织样本及匹配的癌旁正常组织（NAT）由上海市肺病医院（同济大学，上海，中国）提供，并获上海市肺病医院机构审查委员会批准。伦理批准编号为K24-537，所有参与患者均已签署书面知情同意书。标本被归类为NSCLC或NAT，未进行随机分组。参与者年龄35-77岁；12例为男性，3例为女性。9例参与者年龄<65岁，6例参与者年龄≥65岁。与匹配的NAT相比，NSCLC组织中MAT2A表达的增加与年龄组或性别无显著相关性。然而，鉴于样本量较小且男性占多数，这些分析的统计效力有限，不能排除潜在的年龄或性别相关效应。这代表了本研究的局限性。

细胞系

NSCLC细胞系NCI-H1299、NCI-H1975、NCI-H460和A549购自中国科学院细胞库，Calu1购自张乃霞实验室（中国科学院上海药物研究所）。H1299、H1975和H460使用RPMI Medium 1640基本培养基（1×）（Gibco）培养，A549使用DMEM基本培养基（1×）（Gibco）培养，Calu1使用McCoy's 5A（改良）培养基（Gibco）培养，所有培养基均补充10%胎牛血清（FBS）（Gibco）。细胞在37°C、含5% CO?的湿润大气中培养。所有细胞系的身份在分发前均由商业供应商通过短串联重复序列（STR）分析进行鉴定。接收后未进行额外的细胞系鉴定或支原体检测。

方法详情

免疫组织化学染色

人NSCLC冷冻组织样本由Servicebio处理，进行切片、苏木精-伊红染色和IHC染色。简要方法如下：冷冻组织切片在室温下自然干燥并在37°C烘烤10-20分钟，随后在甲醇（MeOH）中固定20分钟。用PBS洗涤后，使用EDTA缓冲液（pH 8.0）在90°C下抗原修复30分钟。自然冷却后，用PBS洗涤三次，并在室温避光条件下用3%过氧化氢孵育25分钟以灭活内源性过氧化物酶活性，随后用PBS洗涤。切片在室温下用3% BSA孵育30分钟以封闭，然后在4°C下与抗MAT2A抗体（#GB114610，Servicebio）孵育过夜。用PBS洗涤后，应用HRP偶联的二抗（#GB23303，Servicebio）并在室温下孵育50分钟。使用DAB底物显色，用水冲洗终止反应。用苏木素复染，然后通过梯度酒精系列脱水，在正丁醇和二甲苯中透明，最后封片。

数据分析使用Aipathwell软件进行。对每个样本，选取三个20倍放大倍率的代表性视野。

MAT2A阳性细胞数与总细胞数经定量后，计算阳性细胞率。每个样本取三个视野的平均值作为最终阳性细胞率。肿瘤组织与癌旁正常组织之间的统计学比较采用配对双尾Student's t检验。

RNA干扰实验

将NSCLC细胞以每孔1.3×10^5个细胞接种于12孔板中，按照说明书使用Lipofectamine 3000（Invitrogen, CA）转染MAT2A、HIF1A siRNA或阴性对照（NC）siRNA，转染时间为6小时。根据敲低效果，选择siMAT2A-1用于主要实验。靶向人MAT2A的siRNA（siMAT2A-1：5′-GGUUCGUGAAGCUGUUAAA-3′，siMAT2A-2：5′-GAGCAACAGUCACCAGAUA-3′）、靶向人HIF1A的siRNA（siHIF1A-1：5′-GUGAUGAAAGAAUUACCGAAU-3′，siHIF1A-2：5′-GGGAUUAACUCAGUUUGAACUAACU-3′）以及NC（NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′）由金唯智（中国苏州）合成。

蛋白质组学分析样本制备

NSCLC细胞经siMAT2A-1或AG-270（MedChemExpress, #HY-138630）处理48小时后，用冷PBS洗涤三次，随后使用SDT裂解液（4% SDS，0.1 M二硫苏糖醇，100 mM Tris-HCL，pH 7.6）收集细胞。按照先前描述的方法，通过色氨酸荧光发射法检测蛋白质浓度。肽段制备按照过滤辅助样品制备（FASP）方案进行。具体而言，将50 μg蛋白样品与200 μL尿素缓冲液（8 M尿素溶于0.1 M Tris-HCl中，pH 8.5）混合，置于10 kDa离心滤器管（Pall Corporation）中，在22°C下以12,000 × g离心。所有后续离心步骤均在相同条件下进行。样品用200 μL尿素缓冲液洗涤两次，然后在室温避光条件下用200 μL尿素缓冲液中的50 mM碘乙酰胺（Sigma）烷基化30分钟，随后用200 μL尿素缓冲液额外洗涤三次，再用200 μL 100 mM碳酸氢铵（ABC）（Sigma）洗涤三次。之后，蛋白质在100 mM ABC中用酶底物比为1:50的测序级胰蛋白酶（Promega）在37°C下消化14小时，随后以1:100的酶底物比在100 mM ABC中于37°C下二次消化4小时。肽段通过离心回收，过滤装置用50 μL 100 mM ABC冲洗并再次离心。所得含肽段的上清液用10%三氟乙酸（TFA）酸化，并通过C18固相萃取（Empore）脱盐。最后，洗脱的肽段使用SpeedVac真空浓缩仪（Thermo Fisher Scientific）干燥，并储存于?80°C直至进行LC-MS/MS分析。

蛋白质组学LC-MS/MS分析

对于siMAT2A-1实验（H1299和H1975细胞系），使用timsTOF Pro质谱仪（Bruker）联用nanoElute UHPLC（Bruker）进行LC-MS/MS分析。样品使用自制1.5 μm C18分析柱（75 μm × 20 cm）进行分离，梯度时间为60分钟。流动相A为0.1%甲酸（FA）溶于H2O中，流动相B为0.1% FA溶于乙腈（ACN）中。LC梯度为：1分钟内2–4% B，47分钟内4–26% B，5分钟内26–32% B，流速为250 nL/min，2分钟内32–90% B，5分钟内90% B，流速为300 nL/min。正离子模式下源毛细管电压设为1500 V，干燥气流量设为180°C下3 L/min。对于数据非依赖采集（DIA），样品采用diaPASEF方法采集，由14个循环组成，共包括28个质量宽度窗口（宽度25 Da，从452到1152 Da）和4个淌度窗口，共计56个窗口，覆盖离子淌度范围（1/K0）从0.76到1.29 V s/cm2，总循环时间约为1.59秒。

对于AG-270实验（H1299和H1975细胞系），使用Orbitrap Q-Exactive HF质谱仪（Thermo Fisher Scientific）联用EASY nLC 1200液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行LC-MS/MS分析。肽段使用自制3 μm C18分析柱（75 μm × 20 cm）进行分离，梯度时间为60分钟，流速为300 nL/min。流动相A为0.1% FA溶于H2O中，流动相B为0.1% FA溶于80% ACN中。LC梯度为：1分钟内2–5% B，46分钟内5–35% B，5分钟内35–45% B，2分钟内45–100% B，6分钟内100% B。质谱仪采用正离子模式。全MS扫描的光谱从350到1650 m/z采集，分辨率为120,000，AGC目标为3×10^6，最大注入时间（IT）为100 ms。对于可变隔离窗口的DIA，分辨率设为30,000，AGC目标为5×10^5，最大IT为45 ms，归一化碰撞能量（NCE）为27%。

对于siMAT2A-1实验和AG-270实验（A549和H460细胞系），使用timsTOF Pro质谱仪（Bruker）联用UltiMate 3000（Thermo Fisher Scientific）进行LC-MS/MS分析。样品使用自制1.5 μm C18分析柱（75 μm × 15 cm）进行分离，梯度时间为60分钟。流动相A为0.1%甲酸（FA）溶于H2O中，流动相B为0.1% FA溶于ACN中。LC梯度为：1分钟内2–4% B，42分钟内4–26% B，5分钟内26–32% B，2分钟内32–90% B，3分钟内90% B，5分钟内90%–5% B，2分钟内5% B，流速为300 nL/min。正离子模式下源毛细管电压设为1800 V，干燥气流量设为180°C下3 L/min。对于DIA，样品采用diaPASEF方法采集，由14个循环组成，共包括28个质量宽度窗口（宽度25 Da，从452到1152 Da），每个窗口含4个淌度窗口，共计56个窗口，覆盖离子淌度范围（1/K0）从0.76到1.29 V s/cm2，总循环时间约为1.59秒。

蛋白质组学数据处理与生物信息学分析

MS原始数据使用DIA-NN软件进行分析，采用无文库模式，默认参数，搜索UniProt人蛋白质数据库。数据矩阵使用各样本总蛋白质的中位数中心化方法进行归一化。每组中保留至少有两个定量值的蛋白质进行后续分析。

对于DIA数据分析，使用R studio、Cytoscape（版本3.9.1）和GraphPad Prism（版本9）进行生物信息学分析。差异的统计分析采用方差相等的双尾Student's t检验计算p值，随后使用错误发现率（FDR）方法进行校正。倍数变化基于每组内的均值计算。热图、PCA图和火山图在R中创建。差异蛋白的功能富集分析包括基因本体（GO）、KEGG富集和GSEA分析，以及通路富集结果的可视化，均使用clusterProfiler、ggplot2和enrichplot R包完成。网络可视化使用Cytoscape生成。

非靶向代谢组学分析样本制备

将H1299细胞培养于10 cm培养皿中，转染100 nM NC或siMAT2A-1。72小时后，非靶向代谢组学样本按如下方法收集。细胞用冷PBS洗涤两次，然后用胰蛋白酶消化。随后细胞再用冷PBS洗涤两次，并计算细胞数。弃去上清液后，将细胞置于液氮中15分钟，然后转移至?80°C。向细胞中加入80%甲醇提取总代谢物，然后放入液氮中5分钟，在冰上复溶，涡旋30秒并超声6分钟。在4°C下以5000 rpm离心1分钟后，将上清液转移至新管中并冻干为干燥粉末。在代谢物提取过程中，将每个样本等体积混合在一起作为QC样本。

非靶向代谢组学LC-MS/MS分析及数据处理

样品用10%甲醇复溶后，在Orbitrap Q Exactive HF-X质谱仪（Thermo Fisher Scientific）联用Vanquish UHPLC（Thermo Fisher Scientific）上进行检测。代谢物使用Hypersil Gold色谱柱（C18）（100 × 2.1 mm，1.9 μm）进行分离，梯度时间为12分钟，流速为0.2 mL/min。柱温为40°C。流动相A为0.1% FA溶于H2O中，流动相B为甲醇。LC梯度为：1.5分钟内2% B，1.5分钟内2–85% B，7分钟内85–100% B，0.1分钟内100%–2% B，1.9分钟内2% B。质谱仪采用正离子和负离子模式。全MS扫描的光谱从100到1500 m/z采集。ESI参数为：喷雾电压3.5 kV，鞘气流量35 psi，辅助气流量10 L/min，毛细管温度320°C，S-lens RF水平为60，辅助气加热温度350°C。MS/MS扫描采用数据依赖模式进行。

原始数据通过ProteoWizard转换为mzXML数据。使用XCMS软件进行峰提取、对齐和保留时间校正。对每个样本中提取的总峰面积进行校正，过滤每组样本中缺失率大于50%的峰。通过搜索Novo本地数据库获取代谢物鉴定信息。进一步的数据分析在Linux系统、R、Python和metaX上进行。p值<0.05（t检验）且VIP>1的组合被认为是具有统计学意义的。

ATAC测序及数据处理

将H1299细胞以每孔3.3×10^5个细胞接种于6孔板中，转染100 nM NC或siMAT2A-1。48小时后，ATAC-seq样本按如下方法收集。细胞用冷PBS洗涤两次，然后用胰蛋白酶消化。随后细胞用冷PBS洗涤一次，然后储存于细胞冻存液（60%完全培养基，30% FBS和10% DMSO）中，置于?80°C条件下。实验设计为每个条件（NC和siMAT2A-1）2个生物学重复。ATAC-seq实验使用Illumina平台Hyperactive ATAC-Seq Library Prep Kit（Vazyme, TD711）按照说明书进行。简要步骤如下：收集50,000个细胞，进行染色质分离，然后在37°C下用Tn5转座酶进行转座切割30分钟。转座切割的DNA随后使用带索引的引物进行PCR扩增并纯化，生成可测序的文库。文库质量和浓度使用Qubit荧光计和Agilent TapeStation进行评估。测序在Illumina NovaSeq平台上使用PE 150 bp模块进行。

原始fastq数据使用fastp处理以去除接头序列和低质量reads。干净reads使用Bowtie2比对至人参考基因组（hg38）。重复reads使用Picard MarkDuplicates工具标记并去除。ATAC-seq峰使用MACS2软件（--nomodel参数）进行呼叫。为可视化目的，使用deepTools（bamCoverage）以每百万计数（CPM）归一化生成归一化覆盖轨道（bigWig文件）。p值<0.05且FC>1.2，或p值<0.05且FC<0.83的组合被认为是具有统计学意义的。

甲硫氨酸剥夺实验

特定培养基按如下方法制备。对照组培养基含有DMEM（高葡萄糖，无谷氨酰胺，无甲硫氨酸，无胱氨酸）（Gibco, #21013024），添加10% FBS，并补充200 μM L-甲硫氨酸（Sigma, #M5308）、4 mM L-谷氨酰胺（Sigma, #G8540）和200 μM L-胱氨酸（Sigma, #C7602）。甲硫氨酸剥夺组培养基与对照组相同，但不添加L-甲硫氨酸。细胞用甲硫氨酸剥夺培养基处理48小时后收集，用于后续实验。

细胞活力检测

将100 μL培养基中的细胞培养于96孔板中，用不同条件处理，包括siMAT2A转染和甲硫氨酸剥夺。使用Cell Counting Kit-8（Beyotime）检测细胞活力。简要步骤如下：向培养基中加入10 μL CCK8，细胞在37°C培养2小时，然后在450 nm波长下检测吸光度值。通过减去背景吸光度来计算相对OD450值。

细胞克隆形成实验

对于siRNA介导的MAT2A敲低实验，首先用靶向MAT2A的siRNA转染细胞，然后在完全培养基中接种约400个细胞于12孔板中，每三天更换一次培养基。

H1299细胞PA挽救实验在12孔板中进行，每孔接种约400个细胞，并用AG-270、PA或其组合进行处理。在转染siMAT2A-1的细胞的PA挽救实验中，每孔12孔板接种约400个细胞，并用PA进行处理。10天后，细胞用PBS洗涤三次，并用甲醇固定1小时，然后向细胞中加入结晶紫溶液。1小时后，用轻柔水洗板，数据以图像形式存储。

细胞凋亡分析

凋亡分析使用Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒（BD Biosciences）。简而言之，6孔板中的细胞经胰蛋白酶消化并用冰冷的PBS洗涤后，悬浮于含有Annexin-V-FITC和PI染色液的1×结合缓冲液中。细胞通过流式细胞术进行分析，结果使用FlowJo软件（10.8.1版）进行分析。

Western blot

细胞在SDT缓冲液中裂解，然后在95°C加热10分钟。加入上样缓冲液后，样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。分离的蛋白质转移到PVDF膜上，随后在室温下用5% BSA封闭1小时。在4°C下用指定的初级抗体过夜孵育后，膜用TBST缓冲液（8 g/L NaCl、200 mM Tris、0.1% Tween 20，pH 7.4）洗涤三次，然后在室温下用HRP偶联的次级抗体孵育1小时。使用Super Signal West Pico化学发光底物（Thermo Scientific）显影蛋白条带。使用的抗体如下：MAT2A（#A19272）、β-Actin（#AC038）、HMGCS1（#A3916）、SQLE（#A2428）、FDFT1（#A4651）、ABCA1（#A22125）来自ABclonal；SCD（#5218）来自GenuIN BIOTECH；FASN（#F0225）来自Selleck；HIF1A（#HA721997）、MYC（#HA721182）、CBS（#ET7109-21）、CDKN1A（#HA722685）来自HUABIO；GAPDH（#M20006）来自Abmart；山羊抗兔（#L3012）、山羊抗鼠（#L3032）来自Signalway Antibody。根据目标蛋白的分子量选择上样对照，以防止条带重叠，实验组和对照组的各目标蛋白强度分别以其各自的上样对照进行归一化比较。据此，GAPDH被用作MAT2A、FDFT1、SQLE和CDKN1A的上样对照，而β-Actin被用作FASN、SCD、HMGCS1、ABCA1、HIF1A、MYC和CBS的上样对照。

实时定量PCR

在12孔板中培养的细胞首先用PBS洗涤两次，并使用TRIzol试剂裂解。通过氯仿液液萃取提取总RNA，随后用异丙醇沉淀并用75%乙醇洗涤。RNA沉淀干燥后，溶于DEPC处理的水中，并使用NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific）进行定量。对于反转录，使用2微克总RNA通过PrimeScript RT试剂试剂盒（Perfect Real Time）（TAKARA）转化为cDNA。随后，1微升cDNA产物在V7实时PCR系统（ABI VIIA7）上使用THUNDERBIRD SYBR? qPCR试剂盒（TOYOBO）进行定量PCR（qPCR）分析。qPCR分析所用引物的序列列于表S2。

棕榈酸挽救的细胞活力测定

对于AG-270组，每孔100微升培养基的细胞在96孔板中培养，并用不同浓度的AG-270和棕榈酸钠（Sigma，#P9767，溶解于BSA中）进行处理。48小时后，向培养基中加入10微升CCK8，在37°C培养2小时，在450 nm OD值处检测细胞活力。对于siMAT2A-1组，细胞在6孔板中培养并转染100 nM NC或siMAT2A-1。24小时后，将NC或siMAT2A-1组的4000个细胞接种于96孔板中，并用不同浓度的PA进行处理。48小时后，通过上述CCK8测定法检测细胞活力。

角鲨烯包括羊毛甾醇、7-去氢胆固醇、胆固醇的LC-MS/MS定量

角鲨烯从6孔板中培养的NSCLC细胞中提取，方法如下。简而言之，细胞经胰蛋白酶消化，用冰冷的PBS洗涤两次。细胞沉淀悬浮于提取溶剂（二氯甲烷:甲醇 = 1:1 (v/v)，含50微克/毫升二丁基羟基甲苯）中超声处理60秒，随后在25°C、5000 rpm下离心5分钟，将上清液转移至微量管中。细胞沉淀用提取溶剂重新悬浮后再离心5分钟，合并上清液并通过氮气吹干蒸发。代谢物用甲醇重新溶解，在30°C下超声10分钟，随后进行靶向LC-MS/MS分析。

所有角鲨烯测定均在TSQ Quantiva质谱仪（Thermo Fisher Scientific）配合UltiMate 3000 UHPLC（Thermo Fisher Scientific）上进行。液相色谱分离使用Poroshell 120 EC-C18柱（3.0 × 50 mm，2.7微米）。溶剂A为甲醇:水（v:v = 1:1），含0.1%乙酸（AA），溶剂B为含0.1% AA的100%甲醇。液相色谱梯度为：2分钟内90%–100% B，4.5分钟100% B，0.2分钟内100%–90% B，1.7分钟90% B，流速为0.45 mL/min。柱温为35°C，进样量为5微升。质谱仪以大气压化学电离（APCI）和多反应监测（MRM）模式运行。MS参数为：鞘气：42 Arb，辅助气：5 Arb，吹扫气：2 Arb，离子传输管温度：271°C，汽化器温度：346°C，CID气：1.5 mTorr。监测的转移和碰撞能量（CE）如下：羊毛甾醇（LANO）m/z 409.3 → 95（CE: 19 V），7-去氢胆固醇（7-DHC）m/z 367.4 → 145.1（CE: 19 V），159.1（CE: 19V），胆固醇（CHOL）m/z 369.4 → 147.1（CE: 22 V），161.1（CE: 19 V）。使用Thermo Xcalibur进行系统控制、数据采集和数据处理。代谢物通过与纯标准品的MRM转移信号和保留时间进行比较进行鉴定。代谢物水平从原始峰面积进行定量。柱状图使用GraphPad Prism（9版）生成。

LC-MS/MS定量S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）从6孔板中培养的NSCLC细胞中按先前描述的方法提取。简而言之，培养的细胞用冰冷的PBS洗涤三次，然后向细胞中加入500微升冰冷的提取溶剂（酸性乙腈/甲醇/水 4:4:2，含0.1 M FA），在?20°C下放置30分钟。收集细胞-溶剂混合物并转移至微量管中，向板中加入200微升提取溶剂以将残余代谢物转移至微量管中，随后在4°C、12,000 g下离心10分钟，上清液在真空浓缩仪中干燥。代谢物用样品上样溶剂（乙腈/甲醇/水 3:5:2）重新溶解以进行靶向LC-MS/MS分析。

所有SAM和SAH测定均在TSQ Quantiva质谱仪（Thermo Fisher Scientific）配合UltiMate 3000 UHPLC（Thermo Fisher Scientific）上进行。液相色谱分离使用ACQUITY UPLC BEH Amide柱（2.1 × 100 mm，1.7微米）。溶剂A为含0.1% FA的水，溶剂B为含0.1% FA的100%乙腈。液相色谱梯度为：0.5分钟93% B，6.5分钟内93-45% B，2.5分钟45% B，0.2分钟内45–93% B，2.5分钟93% B，流速为0.4 mL/min。柱温为35°C，进样量为1微升。质谱仪以正离子电喷雾电离（ESI）和MRM模式运行。MS参数为：正离子喷雾电压：3500 V，鞘气：40 Arb，辅助气：8 Arb，吹扫气：1 Arb，离子传输管温度：350°C，汽化器温度：350°C，CID气：1.5 mTorr。监测的转移和CE如下：SAM m/z 399.17 → 136.04（CE: 26 V），250.07（CE: 214 V），298（CE: 11V）；SAH m/z 385.21 → 134.05（CE: 20 V），136.31（CE: 20 V）。使用Thermo Xcalibur进行系统控制、数据采集和数据处理。代谢物通过与纯标准品的MRM转移信号和保留时间进行比较进行鉴定。代谢物水平从原始峰面积进行定量。柱状图使用GraphPad Prism（9版）生成。

LC-MS/MS定量半胱硫醚

半胱硫醚（Cysta）从6孔板中培养的NSCLC细胞中按先前描述的方法提取。简而言之，培养的细胞用冰冷的PBS洗涤三次，然后向细胞中加入500微升冰冷的提取溶剂（80%甲醇于水中），在?20°C下放置1小时。收集细胞-溶剂混合物并转移至微量管中，向板中加入200微升提取溶剂以将残余代谢物转移至微量管中，随后在4°C、12,000 g下离心10分钟，上清液通过氮气吹干蒸发。代谢物用水重新溶解以进行靶向LC-MS/MS分析。

所有半胱硫醚测定均在TSQ Quantiva质谱仪（Thermo Fisher Scientific）配合UltiMate 3000 UHPLC（Thermo Fisher Scientific）上进行。液相色谱分离使用ACQUITY UPLC HSS T3柱（3.0 × 150 mm，1.8微米）。溶剂A为含0.1% FA的水，溶剂B为100%乙腈。液相色谱梯度为：1分钟5% B，2.8分钟内5–95% B，3.7分钟95% B，0.5分钟内95-5% B，4分钟5% B，流速为0.3 mL/min。柱温为40°C，进样量为1微升。质谱仪以正离子ESI和MRM模式运行。MS参数为：正离子喷雾电压：3000 V，鞘气：35 Arb，辅助气：10 Arb，吹扫气：1 Arb，离子传输管温度：320°C，汽化器温度：300°C，CID气：1.5 mTorr。监测的转移和CE如下：Cysta m/z 223.07 → 88.04（CE: 26 V），134.12（CE: 17 V）。使用Thermo Xcalibur进行系统控制、数据采集和数据处理。代谢物通过与纯标准品的MRM转移信号和保留时间进行比较进行鉴定。代谢物水平从原始峰面积进行定量。柱状图使用GraphPad Prism（9版）生成。

胞外酸化速率评估

使用Seahorse XF 24分析仪（Seahorse Bioscience）测量H1299细胞的胞外酸化速率（ECAR）。每孔接种2 × 10^4个细胞于Seahorse XF 24孔培养板（Bucher Biotech AG）中，使用含10% FBS的RPMI 1640培养基，并用10微摩尔AG-270处理或已转染siMAT2A-1，在37°C/5% CO2培养箱中过夜孵育。细胞用相同的测定培养基洗涤两次后从RPMI 1640培养基更换为XF糖酵解压力测试测定培养基（D5030，Sigma-Aldrich），然后放在37°C/无CO2培养箱中1小时。在第一次注射前测量基础速率三次，然后在指定时间点向每孔分别注入10毫摩尔葡萄糖、1微摩尔寡霉素和100毫摩尔2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）。注射后监测每孔的ECAR，直到速率稳定。整个测量过程完成后，使用EnSight多模式板读数仪（PerkinElmer）通过明场计数和PI染色计算每孔的活细胞数以进行进一步归一化。根据速率测量公式计算指示细胞相应的糖酵解、糖酵解能力和糖酵解逆转参数值。

体外药物联合试验

每孔接种5000个细胞于96孔板中。根据药物联合研究的实验设计，每孔用两种药物的混合物以不同浓度进行处理。48小时孵育后，向每孔加入10微升CCK-8试剂，随后在37°C下再孵育2小时。然后在450 nm处测量吸光度以确定细胞活力。实验使用的化合物如下：TVB-2640（MedChemExpress，# HY-112829），LXR-623（MedChemExpress，#HY-10629），BAY-876（MedChemExpress，#HY-100017），HG106（MedChemExpress，#HY-W451275），NCT-503（MedChemExpress，#HY-101966）。

定量与统计分析

数据以均值±标准差（SD）表示。统计学显著性通过双尾Student's t检验用于两组间比较、单因素ANOVA用于三至四组间比较、双因素ANOVA用于评估两个变量的影响（如治疗组随时间或不同药物浓度的变化）来确定。上述所有统计分析均使用GraphPad Prism（9版）进行。

p值小于0.05（*）、小于0.01（**）、小于0.001（***）或小于0.0001（****）被视为具有统计学显著性。药物组合效应使用SynergyFinder Plus平台进行评估，最高单药（HSA）评分大于10被认为表示具有协同效应。补充信息（12）全部下载PDF（1.76 MB）数据S1. 原始Western blot数据PDF（2.07 MB）文件S1. 图S1–S6和表S1及S2文件（1.09 MB）表S3. siMAT2A-1转染H1299的蛋白质组学数据文件（695.46 KB）表S4. AG-270处理H1299的蛋白质组学数据文件（1.10 MB）表S5. siMAT2A-1转染H1975的蛋白质组学数据文件（695.52 KB）表S6. AG-270处理H1975的蛋白质组学数据文件（1.05 MB）表S7. siMAT2A-1转染A549的蛋白质组学数据文件（881.73 KB）表S8. AG-270处理A549的蛋白质组学数据文件（1.04 MB）表S9. siMAT2A-1转染H460的蛋白质组学数据文件（866.99 KB）表S10. AG-270处理H460的蛋白质组学数据电子表格（971.10 KB）表S11. siMAT2A-1转染H1299的非靶向代谢组学数据工作表1为正极模式数据；工作表2为负极模式数据。文件（10.11 MB）表S12. siMAT2A-1转染H1299的ATAC-seq数据