《Plants》：Genome-Wide Characterization of PEBP, FD, and GRF Families in Amomum villosum Lour. and Their Potential Roles in Flowering
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摘要：目前，对于姜科（Zingiberaceae）药用植物阳春砂（Amomum villosum Lour.）开花时间调控的分子机制尚缺乏详细了解。在现生植物中，已知包含PEBP、FD/bZIP和GRF蛋白的成花激活复合体（florigen activatio
摘要：目前，对于姜科（Zingiberaceae）药用植物阳春砂（Amomum villosum Lour.）开花时间调控的分子机制尚缺乏详细了解。在现生植物中，已知包含PEBP、FD/bZIP和GRF蛋白的成花激活复合体（florigen activation complex, FAC）可调控开花。本研究在阳春砂基因组中鉴定了13个PEBP、5个FD和19个GRF基因，并进行了系统发育、结构和启动子分析。值得注意的是，跨物种蛋白-蛋白相互作用预测和酵母双杂交（yeast two-hybrid, Y2H）实验揭示了一种意料之外的相互作用模式：一个AREB3类FD蛋白（AvFD5）和一个GRF蛋白（AvGRF13）与特定的PEBP成员直接相互作用，而典型的FD样蛋白（AvFD1和AvFD4）则未表现出相互作用，这与经典的水稻FAC模型（Hd3a-14-3-3-OsFD1）形成对比。这些结果表明，阳春砂中的FAC组装可能涉及替代组分或调控机制，可能暗示单子叶植物内的谱系特异性分化。本研究首次对阳春砂及姜科植物中FAC核心基因家族进行了系统鉴定，为理解该经济植物的开花时间调控机制奠定了基础，并为其未来的分子育种工作提供了支持。
**阳春砂PEBP、FD与GRF基因家族全基因组鉴定及其开花调控机制的探索性研究**
**一、研究背景与科学问题**
阳春砂（*Amomum villosum* Lour.）是姜科（Zingiberaceae）豆蔻属的多年生草本植物，其干燥成熟果实即为中药材砂仁（Amomi Fructus），具有安胎、止泻、消食等药理功效，同时被广泛应用于茶饮、食品及化妆品等领域，是中国药监局认定的药食同源物种。然而，阳春砂营养生长期漫长，分株繁殖需2-3年、种子繁殖需3-4年才能进入生殖生长阶段，加之个体农户小规模分散种植模式，严重制约了产业的可持续发展。开花时间是影响阳春砂座果率的核心农艺性状，开花过早、过晚或花期过于集中、分散均会显著降低果实产量，因此解析其开花调控的分子机制对培育早花高产品种具有重要的理论与实践意义。
在被子植物中，光周期途径是调控开花时间的核心通路，其中心组分在不同物种间高度保守。该通路的关键节点是成花激活复合体（florigen activation complex, FAC），由磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP）家族的FT样蛋白、FD样bZIP转录因子以及14-3-3蛋白（又称通用调控因子，general regulatory factors, GRF）三部分构成。FAC通过激活下游花分生组织特性基因如*APETALA 1*和*FRUITFULL*来启动花发育。尽管前期转录组研究已初步揭示阳春砂中存在与开花相关的差异表达基因及高表达的*AvFD1*同源基因，但对该物种中FAC核心组分——*PEBP*、*FD/bZIP*和*GRF*三个基因家族的全基因组规模鉴定与功能解析仍属空白，这限制了对阳春砂开花分子机制的深入理解。
**二、研究内容与核心发现**
本研究对阳春砂基因组中*PEBP*、*FD*和*GRF*三个基因家族进行了全基因组水平的系统鉴定与表征。通过隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model, HMM）搜索与BLAST比对，共鉴定出13个*AvPEBP*、5个*AvFD*和19个*AvGRF*基因。理化性质分析显示，AvPEBP蛋白长度介于167-429个氨基酸（aa）之间，分子量（MW）为18.86-48.13 kDa，等电点（pI）为5.17-9.49；AvFD蛋白长度为210-480 aa，MW为23.08-54.04 kDa；AvGRF蛋白长度为100-431 aa，MW为11.43-47.60 kDa。亚细胞定位预测表明，AvPEBP主要定位于细胞质和叶绿体，AvFD主要定位于细胞核，而AvGRF则分布于叶绿体、质膜、细胞质和细胞核等多种亚细胞位置。
染色体定位与共线性分析显示，37个基因不均匀地分布在21条染色体上。种内共线性分析检测到4对*AvGRF*片段重复、2对*AvFD*共线性关系及1对*AvPEBP*共线性关系。种间共线性分析表明，阳春砂与同为姜目（Zingiberales）的香蕉（*Musa acuminata*）、美人蕉（*Canna indica*）和姜（*Zingiber officinale*）之间存在大量的同源基因对，而与双子叶模式植物拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）之间的共线性关系极为有限，反映了单子叶与双子叶植物间的进化距离。
系统发育分析采用最大似然法（RAxML）、邻接法（NJ）和贝叶斯推断（BI）三种方法，结果高度一致。13个AvPEBP成员被分为三个保守亚家族：FT样分支（8个成员）、TFL1样分支（3个成员）和MFT样分支（2个成员）；5个AvFD成员被分为两个主要分支：典型的FD样分支（AvFD1、AvFD2和AvFD4，与AtFD/AtFDP聚类）和AREB3样分支（AvFD3和AvFD5，与ABA响应元件结合因子聚类）；19个AvGRF蛋白被分为Group I（12个成员）和Group II（7个成员）两大分支。保守基序与结构域分析显示，所有AvPEBP均包含完整的10个基序和PEBP超家族结构域，但AvPEBP10在C端含有一个额外的PTZ00184延伸；AREB3样AvFD成员保留了Motifs 1-8并额外拥有HFD_SF结构域，而FD样成员则逐渐缺失多个基序；Group I AvGRF成员通常保留全部10个基序，Group II成员则存在Motif 2或Motif 8的缺失。基因结构分析显示，*AvPEBP*基因含有4-6个外显子，*AvFD*基因含有3-8个外显子，*AvGRF*基因则呈现1-7个外显子的广泛变异。启动子分析在所有三个家族的多数基因启动子中均发现CAAT-box、TATA-box、光响应元件（Box 4和G-box）以及激素响应元件（ABA响应的ABRE和MeJA响应的CGTCA-motif/TGACG-motif）的富集，其中AREB3样*AvFD*基因启动子中ABRE元件密度更高。
基于7种组织（花、幼叶、根状茎和4个果实发育阶段）的转录组数据分析显示，35个可检测的目标基因被分为6个主要表达簇。AvFD4在多个组织中显著下调，而AvFD1在根状茎中显著上调；AvGRF11、AvGRF3等多个GRF成员在不同组织中表现出差异表达；AvPEBP10在幼叶和根状茎中显著上调而在果实中下调。值得注意的是，AvFD1/AvFD4与AvPEBP之间未检测到预期的相互作用。
跨物种蛋白-蛋白相互作用（PPI）预测结合酵母双杂交（Y2H）实验验证揭示了非经典的FAC组装模式。基于拟南芥同源物的预测暗示FD样蛋白与FT样PEBP之间存在强相互作用（分数950），而基于水稻同源物的预测结果与Y2H实验一致，表明典型的FD样蛋白（AvFD1和AvFD4）未与所测试的PEBP成员发生直接相互作用。相反，AREB3样FD蛋白AvFD5与多个PEBP成员（AvPEBP1、AvPEBP4、AvPEBP6和AvPEBP8N端）表现出阳性相互作用，GRF蛋白AvGRF13与AvPEBP3表现出最强的直接相互作用（在DDO+X+A、TDO+X+A和QDO+X+A三种筛选培养基上均生长并激活全部三个报告基因），而AvGRF4-AvPEBP6和AvGRF16-AvPEBP1组合仅表现出较弱或中等强度的相互作用。这一相互作用模式与经典的水稻FAC模型（Hd3a-14-3-3-OsFD1）明显不同。
**三、研究结论与意义**
本研究首次在姜科植物中对*PEBP*、*FD*和*GRF*三个基因家族进行了全基因组水平的系统鉴定与表征。系统发育分析揭示了三个家族的保守分类与谱系特异性扩张特征，其中FT样*PEBP*基因的数量（n=8）显著多于拟南芥（n=2），表明姜目植物中存在FT样基因的谱系特异性扩张。FD家族可分为FD样和AREB3样两个分支，反映开花调控与胁迫响应之间的功能分化。GRF家族的成员数量（n=19）与水稻和玉米等其他单子叶植物相当，表明该家族在姜目进化过程中相对稳定。
研究结果挑战了经典的FAC组装模型在阳春砂中的适用性。Y2H实验揭示，AREB3样蛋白AvFD5而非典型的FD样蛋白AvFD1/AvFD4与多个PEBP成员相互作用，GRF蛋白AvGRF13与AvPEBP3表现出强相互作用，而经典组合（如AvFD1-AvPEBP8）则未检测到相互作用。这种非典型的相互作用模式暗示阳春砂中FAC的组装可能涉及其他未知组分、特定的翻译后修饰或辅助因子，其组装机制可能不同于经典的水稻范式（Hd3a/14-3-3/OsFD1）。这一发现为理解单子叶植物中FAC的谱系特异性分化提供了新的视角。
此外，跨物种PPI分析还揭示了PEBP成员作为中枢枢纽与多个核糖体蛋白（RL23、RL33、RL34、RS5、RT29、RK5等）及未表征蛋白Y6344之间的保守相互作用（分数>900），暗示PEBP蛋白在翻译调控或核酸相关过程中可能具有此前被低估的作用。FD-SAPK相互作用网络的发现则支持FD样蛋白在非生物胁迫信号级联中的保守功能。
本研究为深入理解阳春砂开花时间调控的分子机制奠定了重要基础，为该药用植物的分子育种工作提供了宝贵的基因资源和理论依据。未来的研究应结合免疫共沉淀、三元复合体重构实验以及翻译后修饰或辅助因子的系统筛选，以全面阐明阳春砂中FAC组装的精确机制。
