热应激诱导的布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）雄性生殖功能障碍：内质网应激的核心作用

《Biology》：Heat Stress-Induced Male Reproductive Dysfunction in Brandt’s Vole (Lasiopodomys brandtii): A Central Role for Endoplasmic Reticulum Stress

　　

全球气温持续上升对野生小型哺乳动物的种群延续构成严重威胁。本研究以欧亚温带草原的优势小型哺乳动物——布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）为对象，探讨热诱导睾丸损伤的分子机制。研究人员将成年雄性个体分别暴露于37°C、39°C和41°C的短期热应激环境。≥39°C的热应激显著降低了睾丸指数并造成组织病理学损伤。整合转录组学与数据非依赖性采集（data-independent acquisition, DIA）蛋白质组学分析显示，与内质网（endoplasmic reticulum, ER）蛋白质加工及屏障功能相关的通路显著富集。进一步的分子验证显示，关键ER应激标志物显著上调，包括总eIF2α、ATF4、ATF6B和XBP1，提示未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）可能参与其中。综上，这些结果确定ER应激是热诱导睾丸损伤的关键介质，并强调即使短期暴露，41°C也可导致布氏田鼠ER应激标志物的显著激活及严重的睾丸损伤。

全球变暖背景下，热应激对野生小型哺乳动物雄性生殖的影响已成为生态学和生殖生物学的重要交叉问题。雄性哺乳动物的精子发生具有高度温度依赖性，阴囊温度通常需维持在核心体温以下2–4°C；环境温度升高易破坏精子发生稳态，导致精子质量下降和雄性不孕。布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）是欧亚温带草原的优势小型哺乳动物，其种群动态显著影响草地结构和生态系统功能。内蒙古温带草原区域增温速率约为每十年0.37°C，是同期全球平均增速的3倍，2021年当地实测极端气温达42.3°C，而近地表微气候温度对布氏田鼠的影响更为直接。已有研究提示，内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激信号在精子发生、精子成熟和受精过程中发挥关键作用，多种因素诱导的睾丸功能障碍与ER稳态受损及未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）密切相关。然而，热应激、ER应激与野生小型哺乳动物睾丸损伤之间的分子机制仍不清楚。研究人员据此提出“气候变暖可能通过ER应激损害布氏田鼠雄性生殖功能”的假设，利用整合转录组学与蛋白质组学解析其分子基础。该研究为理解气候变化和极端高温事件如何威胁野生动物种群提供了重要证据，论文发表在《Biology》。

研究人员使用48只来自内蒙古锡林浩特草原野生种群后代的成年雄性布氏田鼠（45 ± 5.5 g，9–10周龄），随机分为对照组（22 ± 2°C）和37°C、39°C、41°C热应激组，每组12只。通过水浴加热下腹部和阴囊30分钟进行单次热暴露，恢复24小时后取材。主要关键技术方法包括：组织学H&E染色评估睾丸结构；透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察ER和线粒体超微结构；生化检测氧化应激指标（GSH、MDA、SOD、CAT）；qRT-PCR和Western blot检测ER应激相关标志物；RNA测序（每组5个生物学重复）与DIA蛋白质组学（每组3个生物学重复，基于转录组筛选结果选择39°C组）进行整合分析，并进行GO和KEGG通路富集。

### 3.1 热应激损伤睾丸组织学结构
与对照组相比，39°C和41°C热暴露组的睾丸指数显著降低，37°C组无显著变化。精子形态评估显示，热应激组出现断尾、多头、卷尾等明显异常。组织学观察显示，热应激组出现血管淤血、生精小管形态不规则和生精上皮紊乱。TEM进一步显示，热应激导致线粒体完整性严重受损，并出现明显的ER肿胀。

### 3.2 热应激诱导睾丸氧化应激
与对照组相比，39°C和41°C组睾丸组织中GSH含量显著降低，SOD活性显著升高；37°C组无显著变化。MDA水平在所有热应激组中均无显著波动。CAT活性仅在41°C组显著降低。这些结果表明热应激打破了睾丸的氧化还原稳态和抗氧化级联平衡。

### 3.3 热应激扰乱睾丸屏障功能
与对照组相比，Cldn1的mRNA水平在37°C和39°C组无显著变化，但在41°C组显著上调。而Ocln和Tjp1的表达在热应激组中均受到显著抑制，提示血-睾屏障（blood–testis barrier, BTB）相关紧密连接蛋白表达受损。

### 3.4 热应激诱导睾丸ER应激
转录水平上，Ddit3和Qrich1的mRNA丰度在热应激下显著下调；Atf4和Xbp1仅在41°C组显著上调。Western blot结果显示，ATF4、ATF6B、总eIF2α和XBP1的蛋白表达仅41°C组显著升高。这种温度选择性激活表明41°C是布氏田鼠睾丸发生显著ER应激的关键温度阈值。

### 3.5 RNA测序数据过滤结果
质控后，高质量过滤reads比例为99.92%–99.93%；每样本获得57.02–91.85 M条clean reads，最低Q30为92.97%；共鉴定673,474条转录本，reads平均比对率为86.66%。

### 3.6 功能注释
共350,367个unigenes在至少一个数据库中获得注释。其中，NR数据库注释63,463个，Swiss-Prot注释60,107个，Pfam注释59,484个；GO功能分类注释57,631个，eggNOG注释43,964个，KEGG通路注释40,680个。

### 3.7 差异表达基因鉴定
与对照组相比，C37组共鉴定到1344个差异表达基因（DEGs），其中上调645个、下调699个；C39组DEGs数量最多，共3248个，上调1876个、下调1372个；C41组共1580个，上调763个、下调817个。Venn图分析显示，三种热应激处理共有340个共同DEGs。

### 3.8 基于温度过程的DEG聚类分析
聚类分析显示，聚类1基因在37°C维持基础水平，39°C出现短暂峰值后在41°C下降；聚类2、4、5呈“V”形变化轨迹，即在37°C或39°C显著下调后在41°C强烈上调；聚类3基因随温度升高呈渐进性上调；聚类6基因在所有热应激处理下均持续受到抑制；聚类7和9呈倒“V”形，在37°C或39°C增强表达后下降；聚类8则在37°C上调后于39°C降低。

### 3.9 DEG的GO和KEGG富集分析
GO富集显示，C37、C39、C41组分别有833、1734、995个DEGs归入54、53、52个功能亚类，主要富集于“对刺激的反应”、“膜部分”和“抗氧化活性”。KEGG通路分析分别将1311、2412、1536个DEGs映射到不同生物学通路，主要涉及环境信息处理、生物体系统和人类疾病。

### 3.10 qRT-PCR验证DEGs
研究人员选取15个涉及ER应激、炎症、蛋白质质量控制及代谢调控的代表性DEGs进行qRT-PCR验证。结果显示，Cebpd、Socs3、Hspb1、Atf3、Marchf10、Spata21、Mns1、Sec11a、Ccdc33、Ptgs2、Iqub和Umod显著上调，Pnpla3、Gli1和Aqp2显著下调，与RNA-seq方向高度一致，Pearson相关系数r = 0.83，p < 0.001。

### 3.11 蛋白质鉴定与定量
DIA蛋白质组学共鉴定5808个高置信蛋白。主成分分析（principal component analysis, PCA）显示，PC1解释了36.0%的总方差，明确区分对照组与39°C组。对照组与39°C组之间共鉴定到394个差异表达蛋白（DEPs），其中233个上调，161个下调。

### 3.12 功能分类分析
DEPs主要定位于原生质、细胞质、细胞质颗粒腔、细胞质颗粒膜和细胞质颗粒。生物过程类别中“生殖”（GO:0000003）富集程度最高，含39个DEPs；细胞组分富集于核染色体、高尔基体膜和泛素连接酶复合物；分子功能以核苷酸结合和转录顺式调控区结合为主。KEGG富集显示MAPK信号通路和紧密连接显著富集；热应激上调的DEPs主要涉及ER蛋白质加工、神经营养因子信号通路和沙门氏菌感染通路；下调的DEPs主要涉及醛固酮调节的钠重吸收和癌症相关通路。

讨论部分指出，布氏田鼠是研究气候变暖损害野生小型哺乳动物繁殖能力的理想模型。39°C或41°C单次30分钟热暴露足以降低睾丸指数、诱导精子形态异常并导致生精上皮广泛变性。热应激引起的GSH耗竭、SOD升高和CAT降低提示抗氧化级联失衡，可能造成H₂O₂清除不足；Ocln和Tjp1表达下降提示BTB结构受损，而Cldn1上调可能是一种保护性代偿，但仍需直接功能证据。转录组、蛋白质组与超微结构证据共同支持ER应激是热诱导睾丸损伤的潜在关键介质。Ddit3和Qrich1下调可能反映UPR早期保护机制，也可能提示生殖细胞丢失通过其他途径发生。研究局限性包括：局部阴囊加热不能完全模拟全身热浪；缺乏ER应激药理学干预的直接因果证据；仅评估24小时恢复时间点；蛋白质组学仅在39°C条件下开展；未在非模式物种中进行独立抗体验证。

结论：本研究表明，短期