《Biology》：Graded Mulberry Leaf Supplementation Shapes Gut Microbiota, Reprograms Intestinal Metabolism, and Maintains Intestinal Chemical–Immune Barrier Homeostasis in Amur Sturgeon: A Multi-Omics Study
编辑推荐：
桑叶含有丰富的具有抗氧化和免疫调节活性的植物化学物质。然而，关于其对史氏鲟肠道健康剂量依赖性调节作用的系统性认识仍然有限。在本研究中，研究人员采用多组学方法，包括16S rRNA基因测序、非靶向代谢组学、转录组学以及RT-qPCR，研究史氏鲟（Acipense
桑叶含有丰富的具有抗氧化和免疫调节活性的植物化学物质。然而，关于其对史氏鲟肠道健康剂量依赖性调节作用的系统性认识仍然有限。在本研究中，研究人员采用多组学方法，包括16S rRNA基因测序、非靶向代谢组学、转录组学以及RT-qPCR，研究史氏鲟（Acipenser schrenckii）日粮中添加梯度桑叶的效果。在为期10周的饲养试验中，幼鲟被投喂四种实验日粮，分别含有0%、2%、4%和6%的桑叶。日粮中添加桑叶对生长性能和肠道消化能力无不良影响。尽管肠道菌群的整体结构保持稳定，但有益细菌类群以剂量依赖的方式得到富集。肠道代谢发生层次性重塑：低添加水平支持基础营养代谢，中添加水平增强抗氧化能力，高添加水平重编程脂质代谢和免疫功能。桑叶通过平衡氧化还原稳态和降低黏膜上皮通透性来增强肠道化学屏障。此外，肠道免疫通过三个连续阶段进行调节：初始先天免疫启动、B细胞归巢以及持续免疫耐受的建立。总之，桑叶以剂量可调的方式维持肠道化学-免疫屏障稳态，支持其作为功能性水产饲料原料的潜在应用。
# 桑叶调控史氏鲟肠道化学-免疫屏障稳态的多组学研究解读
## 研究背景与意义
史氏鲟（Acipenser schrenckii）隶属鲟科，是我国特有的珍贵淡水鱼类，具有极高的食用和商业价值。作为起源于约2亿年前的古老水生物种，鲟鱼被视为典型的“活化石”，是探索脊椎动物起源与进化的重要模型。鲟鱼鱼子酱被称为“黑黄金”，是全球贸易的高端功能性水产食品。肠道生理状态和稳态代谢是鲟鱼营养物质消化吸收的基础，直接影响机体品质和生长性能。在亲鱼中，鱼体的代谢和营养状态是决定鱼子酱产量和品质的关键因素。因此，肠道健康通过调节可用于繁殖的代谢资源，可能间接影响鱼子酱品质。
肠道化学-免疫屏障构成了水生和陆生脊椎动物保守的核心黏膜防御系统。其稳态精确调节宿主与微生物之间的相互作用，阻断病原入侵，并协调平衡的炎症反应和抗氧化代谢。日粮条件不佳引发的肠道屏障功能破坏容易导致氧化应激、持续性黏膜炎症和肠道微生态失衡。在此框架下，探索具有抗氧化、抗炎和肠道保护能力的天然可食用植物资源，有助于制定营养策略来稳定肠道免疫稳态并维持水生动物的生理品质。
桑叶（Morus alba L.）是中华人民共和国国家卫生健康委员会正式认定的药食同源资源，富含黄酮类、多糖和1-脱氧野尻霉素（DNJ）等天然生物活性植物化学物质，在多种生物模型中发挥显著的抗氧化、抗炎和代谢调节作用。中国拥有巨大的桑树资源，但绝大多数桑叶生物质未被充分利用。已有证据表明，日粮中添加桑叶可改善水产养殖物种的消化、抗氧化能力和免疫性能。然而，桑叶生物活性物质调节肠道化学-免疫屏障稳态的分子机制仍不清楚，其剂量依赖性效应在史氏鲟中尚未阐明，也缺乏整合16S rRNA微生物组、转录组和非靶向代谢组学并结合分子验证的研究策略。
## 研究开展的主要内容
研究人员设计了四种等氮等能日粮，分别含有0%（CK）、2%（ML2）、4%（ML4）和6%（ML6）的桑叶，对初始体重为198.64 ± 0.99 g的320尾史氏鲟幼鱼进行了为期10周的饲养试验。桑叶粉购自河南省商丘市睢县石巢水果木种植农民专业合作社，6月采收，自然阴干后粉碎。600尾幼鱼来自北京史氏鲟良种繁育基地，经4周驯化后，随机分为4个处理组，每组4个重复，每个重复20尾鱼。试验结束后采集血清、前肠、中肠和后肠样品，进行生长性能、血清生化与抗氧化指标、肠道消化酶活性、组织形态、肠道通透性、16S rRNA基因测序、非靶向代谢组学、转录组学及RT-qPCR验证分析。所有动物实验经贵州大学实验动物伦理审查（批准号EAE-GZU-20240E072）批准，并遵循ARRIVE 2.0指南。
## 主要研究结果
### 3.1 生长性能与形态参数
与对照组相比，各桑叶添加组的终末体重（FBW）、存活率（SR）、增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、摄食率（FR）、肥满度（CF）和脏体指数（VSI）均无显著差异（p > 0.05）。ML6组的肝体指数（HSI）较对照组显著降低（p < 0.05），且HSI随日粮桑叶添加水平升高呈显著线性下降趋势（p
linear < 0.05）。这表明桑叶对生长无不良影响，并可能改善肝脏代谢状态。
### 3.2 血清抗氧化与免疫指标变化
与CK组相比，ML2和ML4组的超氧化物歧化酶（SOD）活性显著升高，丙二醛（MDA）含量显著降低（p < 0.05），且呈显著二次曲线关系。SOD活性在桑叶添加水平为3.08%时达到最大值，MDA含量在3.26%时达到最小值。ML4组的总抗氧化能力（T-AOC）显著增强，并随桑叶水平升高呈显著线性上升趋势。所有桑叶添加组的补体3（C3）浓度均显著高于对照组，呈线性增加趋势。血清免疫球蛋白M（IgM）在所有处理组显著上调，在5.58%添加水平达到峰值。ML6组的碱性磷酸酶（ALP）活性显著升高并呈线性上升趋势。这些结果表明桑叶梯度添加可剂量依赖性地增强全身抗氧化和体液免疫能力。
### 3.3 肠道消化功能、屏障相关指标与形态变化
各组间肠道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性以及绒毛高度均无显著差异（p > 0.05）。ML6组的隐窝深度较CK组显著增加，且呈显著剂量依赖性响应。ML4和ML6组的肠道二胺氧化酶（DAO）活性显著降低，并呈显著线性下降趋势，表明肠道黏膜通透性降低。ML2组的肠道杯状细胞数量显著高于对照组。这些结果说明桑叶在不影响消化功能的前提下，通过增加杯状细胞数量和降低DAO活性来增强肠道化学屏障和上皮完整性。
### 3.4 肠道微生物群落组成与多样性
16S rRNA基因测序显示，各处理组间α多样性指数（Chao1、Observed species、Shannon、Simpson）无显著差异。β多样性分析中，NMDS排序压力值为0.121，PERMANOVA显示各组间肠道微生物群落结构无显著整体改变（p = 0.28）。在门水平上，ML添加组中厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度最高（46.18%–51.44%），而CK组中变形菌门（Proteobacteria）占优（40.09%）。放线菌门（Actinobacteriota）相对丰度在ML组降低，拟杆菌门（Bacteroidota）相对丰度随桑叶添加水平升高而递增。属水平上，Clostridium_P和Dwaynesavagella表现出明显的数值变化，多个潜在益生菌属如Lactococcus_A和Bacillus_P在ML组中相对丰度更高。LEfSe分析鉴定出各组差异生物标志物：CK组富集Cypionkella、Escherichia和Clostridium_T；ML2组富集芽孢杆菌目Bacillales_B和赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus；ML6组富集红杆菌目Rhodobacterales、红杆菌科Rhodobacteraceae、Priestia和Saccharofermentans。这表明桑叶在维持整体菌群结构稳定的前提下，定向富集有益菌并减少潜在有害菌。
### 3.5 代谢物分布与KEGG通路富集分析
非靶向代谢组学共鉴定出72种差异代谢物，包括脂质、有机酸、有机杂环化合物和苯丙素类等。其中32种代谢物在ML2、ML4和ML6组中持续上调，35种持续下调。ML2组中ABC转运蛋白通路富集最显著，同时富集氨基酸生物合成、牛磺酸和亚牛磺酸代谢及初级胆汁酸生物合成等基础代谢通路。ML4组富集精氨酸生物合成和牛磺酸代谢，并新富集三羧酸循环（TCA循环）、磷酸戊糖途径和溶酶体通路。ML6组显著富集不饱和脂肪酸代谢通路（α-亚麻酸代谢、半乳糖代谢和花生四烯酸代谢），以及溶酶体、FoxO信号通路和C型凝集素受体信号通路等抗氧化和免疫相关通路。这些结果显示了桑叶剂量依赖性的肠道代谢重编程特征。
### 3.6 基因表达与功能富集分析
与CK组相比，ML2、ML4和ML6组分别有164、260和334个基因显著上调，581、469和595个基因显著下调。KEGG富集显示，ML2组富集胰腺分泌和蛋白质消化吸收通路，且细胞因子-细胞因子受体相互作用通路特异性富集。ML4组富集抗原加工呈递和吞噬体等免疫相关通路。ML6组以抗原加工呈递为最显著富集通路，同时富集溶酶体、凋亡和吞噬体等细胞稳态和先天免疫通路。GO富集网络显示，ML2组的GO术语分为营养消化水解、氧运输与抗氧化稳态、维生素转运代谢三个功能模块。ML4组在保留消化和抗氧化模块的基础上，新增蛋白质折叠与错误折叠蛋白修复模块以及阳离子/金属离子结合和脂质转运模块。ML6组则呈现显著重构的模式，以免疫反应相关术语（B细胞受体复合物、免疫球蛋白复合物、免疫系统过程）为主要模块，并保留蛋白质折叠模块，新增糖苷分解代谢和跨膜运输模块。这说明不同剂量桑叶触发差异化的基因表达重编程。
### 3.7 肠道菌群与代谢组整合分析
Spearman相关分析显示，ML2组中桑叶富集属（Priestia、unclassified_f_DSM-18226）与特定代谢物簇呈显著正相关，而CK富集属（Clostridium_T、Gemmobacter_B等）呈相反相关模式。ML4组中上调属（Priestia、unclassified_c_Bacilli、Bacillus_P等）与上调代谢物广泛正相关，而Desulfovibrio_R呈现相反模式。ML6组所有ML富集属与M-C1/M-C2/M-C3代谢物簇正相关，与M-C4负相关。这揭示了菌群-代谢物之间的剂量依赖性协同变化。
### 3.8 肠道转录组与代谢组整合分析
Pearson相关分析显示不同处理组呈现不同的基因-代谢物相关网络。ML2组中多个基因簇与M-C2代谢物簇显著负相关。ML4组呈现复杂的双向关联模式。ML6组则表现出全局一致性趋势：所有基因簇与M-C2显著负相关，与M-C3显著正相关。这表明高剂量桑叶诱导基因表达与代谢谱形成紧密协调的重编程网络。
### 3.9 RT-qPCR验证差异表达基因
RT-qPCR结果显示，TLR-NF-κB信号通路上游基因tlr2-2、tlr7、myd88和map3k14在各组间无显著差异，而nfkb1在ML4组表达显著高于ML6组。趋化因子基因cxcl13在ML6组显著下调，cxcl8在ML2组显著降低。炎症细胞因子基因中，tnfα无显著差异，促炎基因il1β和tgfβ在ML2组显著上调，抗炎基因il10在ML4和ML6组显著高于CK和ML2组。抗氧化基因keap1在CK和ML2组表达较高，sod1在ML2组达到峰值，nrf2和mafk在ML4组显著降低，cat在ML4和ML6组显著高于CK。这些结果验证了转录组学发现，并揭示了桑叶调节免疫和抗氧化通路的剂量特异性模式。
## 讨论与结论
讨论部分指出，梯度桑叶添加未影响生长和消化能力，排除了生长抑制和消化功能障碍作为混淆因素。桑叶选择性富集有益功能菌群，在维持菌群整体稳态的同时减少潜在病原菌。肠道代谢呈现剂量依赖性重塑：低剂量优化基础营养代谢，中剂量强化抗氧化和抗应激能力，高剂量重编程脂质代谢并增强肠道免疫稳态。桑叶通过促进杯状细胞增殖和黏蛋白合成增强化学屏障，并通过调节SOD、CAT等抗氧化酶维持氧化还原平衡，降低DAO活性以减少肠道通透性。免疫调节方面，桑叶通过三个阶段顺序激活肠道免疫：初始先天免疫启动（ML2）、B细胞归巢（ML4）和长期免疫耐受建立（ML6）。低剂量时il1β和tgfβ适度上调激活先天免疫，同时维持免疫耐受；中剂量时nfkb1驱动cxcl13表达介导B细胞归巢，并诱导il10发挥抗炎作用；高剂量时B细胞受体信号通路和免疫球蛋白复合物富集，成熟B细胞定居黏膜并持续分泌IgM，同时溶酶体和凋亡通路清除衰老细胞，隐窝深度增加促进上皮更新，ALP活性升高反映上皮修复。最终，化学屏障与免疫屏障协同作用，通过肠-肝轴降低内毒素易位，改善肝脏代谢状态。
结论部分翻译如下：在本实验范围内，日粮中梯度添加桑叶对史氏鲟的生长性能和肠道消化能力无负面影响。桑叶引起肠道微生态的温和且靶向的调节：有益功能菌群以剂量依赖方式富集，同时肠道微生物群落的整体稳定性得以保持。日粮桑叶水平的逐步升高驱动肠道代谢的逐步重编程，产生剂量特异性的代谢特征，支持持续生长、抗应激和免疫调节。此外，桑叶增强肠道化学屏障，平衡氧化还原稳态并降低肠道上皮通透性。机制上，桑叶通过三个连续阶段重塑肠道免疫：适度先天免疫启动、B细胞的募集和黏膜定植，以及长期耐受性免疫稳态的建立。这种免疫调节与增强的化学屏障功能协同作用，维持全面的肠道健康。从应用角度看，基于每公斤增重饲料成本的初步经济评估显示，2%桑叶添加水平具有最低生产成本（14.50元/公斤，对照组为15.06元/公斤），表明其潜在的成本优势有待商业条件下进一步验证。总之，多组学整合揭示了桑叶维持肠道化学-免疫屏障稳态的复杂剂量依赖性调控网络，这些发现增进了对植物源生物活性化合物调节鲟鱼黏膜先天性和适应性免疫机制的理解。
