《Horticulturae》：1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate Deaminase-Producing Bacteria Associated with Phlebopus portentosus Using Culture-Independent and -Dependent Methods
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研究人员调查了巨核孢牛肝菌（Phlebopus portentosus）覆土中产1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶细菌（ACC deaminase-producing bacteria）的多样性及其在子实体发育中的作用。通过acdS基因高通量测序、富集分
研究人员调查了巨核孢牛肝菌（Phlebopus portentosus）覆土中产1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶细菌（ACC deaminase-producing bacteria）的多样性及其在子实体发育中的作用。通过acdS基因高通量测序、富集分离及共培养试验，分析了覆土在原始覆土（FT）、菌丝期（JS）、针头期（EJ）、原基期（YJ）和采收期（CS）等不同发育阶段的产ACC脱氨酶功能微生物群落动态演替。结果表明，acdS基因群落的丰富度和多样性在JS样品中最高，在EJ和CS阶段显著下降。子实体形成后变形菌门（Proteobacteria）成为优势门，相对丰度达99%，而放线菌门（Actinobacteria）相对丰度显著降低。属水平上，伯克霍尔德菌属（Burkholderia）和副伯克霍尔德菌属（Paraburkholderia）在各发育阶段均占优势。通过富集培养共分离到177株产ACC脱氨酶细菌，全部属于伯克霍尔德菌属（Burkholderia）。共培养试验显示，其中10株代表菌株显著促进菌丝生长、原基形成和子实体产量，最高增产达54%。本研究首次系统揭示巨核孢牛肝菌覆土中产ACC脱氨酶细菌的演替规律，为阐明覆土微生物促进子实体发育的分子机制提供重要依据。
研究背景与立项依据
巨核孢牛肝菌（Phlebopus portentosus）是牛肝菌科中首个实现工业化规模栽培的物种，覆土是其子实体分化和产量的关键诱导因子，无覆土或经高温灭菌的覆土均不能支持正常出菇，而未经处理的土壤可有效促进原基形成，且各处理间理化性质（氮、磷、钾）无显著差异，提示生物因素起核心作用。双孢蘑菇（Agaricus bisporus）等研究表明，覆土微生物可通过降解木质纤维素、分泌生长因子、清除抑制性代谢产物等多途径促菇，其中乙烯清除途径研究最深入：真菌自身合成乙烯积累会抑制原基形成，而部分细菌分泌ACC脱氨酶（ACC deaminase）将乙烯前体ACC降解为α-酮丁酸和氨，降低乙烯水平从而解除抑制。产ACC脱氨酶细菌广泛分布于植物根际与土壤，但在巨核孢牛肝菌覆土生态系统中尚缺乏系统研究，且acdS基因（编码ACC脱氨酶的功能基因）高通量测序尚未应用于该菌不同发育阶段覆土。因此，研究人员开展本研究以明确覆土中产ACC脱氨酶细菌的组成、动态及功能。
主要技术方法概要
研究人员在云南景洪现代化菇房采集巨核孢牛肝菌覆土样本，设原始覆土（FT，第0天）、菌丝期（JS，第40天）、针头期（EJ，第43天）、原基期（YJ，第45天）、采收期（CS，第47天）五个时间点，每期3个生物学重复。核心技术包括：基于acdSF5/acdSR8特异引物的acdS基因扩增子高通量测序（Illumina MiSeq，97%相似度OTU聚类）；以ACC为唯一氮源的DF（Dworkin-Foster）改良培养基（ADF）进行产ACC脱氨酶菌富集、分离与16S rDNA鉴定；DNPH比色法测ACC脱氨酶酶活、qPCR测acdS表达；平板对峙与共培养覆土接种评价促菌丝生长、原基数与产量。
研究结果
3.1 测序：15个样本acdS扩增子有效序列7.7万–13.0万条，合并率>98.5%，质量过滤保留率约84.7%–87.5%，数据可用于群落分析。
3.2 多样性分析：Chao1与Shannon指数均在JS期最高，EJ期骤降，YJ略升但仍低于JS，CS最低；PERMANOVA证实阶段间群落结构差异显著（Pseudo-F=5.91，p=0.001），PCoA显示EJ、CS与JS、FT分离明显。
3.3 群落组成：门水平变形菌门（Proteobacteria）从FT/JS约87%升至EJ-YJ-CS约99%，放线菌门（Actinobacteria）显著下降；属水平伯克霍尔德菌属（Burkholderia）与副伯克霍尔德菌属（Paraburkholderia）全程优势，链霉菌属（Streptomyces）在JS前较高、EJ后锐减至CS的0.64%。
3.4 标志分类群：JS期富集Cupriavidus oxalaticus、Delftia、Variovorax paradoxus、Bradyrhizobium等；EJ期以Paraburkholderia caribensis和Burkholderia oklahomensis为主；YJ期Burkholderia multivorans（LDA=4.90）最突出；CS期伯克霍尔德菌科（Burkholderiaceae）及Paraburkholderia、Burkholderia属及多种Burkholderia/Paraburkholderia种LDA最高。
3.5 富集分离：177株可培养产ACC脱氨酶菌全为伯克霍尔德菌属（Burkholderia），含B. gladioli、B. ambifaria、B. multivorans、B. cepacia等10种，以前三者及B. cepacia居多。
3.6 酶活与表达：10株酶活在191.6–378.6 U/L间，菌株3、4、8最高；acdS相对表达量与酶活除菌株4外一致性差。
3.7 促生共培养：平板中对照菌丝生长率0.85 cm/d，菌株5和9达2.35 cm/d（约3倍）；针头数对照5.5个/千克干料，菌株9达20个；产量对照196.58 g/kg，菌株10达303.43 g/kg（增产54%），菌株4、5次之，菌株7反而抑制产量。
讨论与结论翻译
讨论指出，覆土微生物在食用菌栽培中不可替代，本研究acdS群落动态与既往16S rRNA总细菌趋势一致，但产ACC脱氨酶可培养组全为Burkholderia，不同于双孢蘑菇覆土中以假单胞菌属（Pseudomonas）和黄杆菌属（Flavobacterium）为主的情形；培养依赖与非依赖结果互补，ADF富集偏向快长Burkholderia。Burkholderia具产ACC脱氨酶、固氮、泌IAA、耐逆及内生定殖能力，但部分B. cepacia复合体种及B. gladioli为人机会致病菌，工业化接种前需做菌株级致病性与产毒评估。
结论部分翻译如下：本研究通过高通量测序、富集分离与共培养系统揭示巨核孢牛肝菌不同发育阶段覆土中产ACC脱氨酶细菌的多样性、群落结构与功能。acdS基因群落丰富度与多样性在菌丝期最高，随子实体发育显著下降；子实体启动后变形菌门（Proteobacteria）占优，伯克霍尔德菌属（Burkholderia）与副伯克霍尔德菌属（Paraburkholderia）全程核心；177株富集菌全属Burkholderia；共培养证其实株显著促菌丝生长、原基形成与产量（最高+54%）。本研究首次将acdS高通量测序用于该菌覆土生态，确立Burkholderia为关键功能菌组，印证ACC脱氨酶途径在覆土促生中的重要性，为优化覆土配方、开发微生物强化覆土材料、提升工业栽培效率提供理论基础与微生物资源。论文发表于《Horticulturae》。
