在酵母中高产制备免疫原性PV3类病毒颗粒

《Antiviral Research》：High-yield production of immunogenic PV3 virus-like particle in yeast

　　VP0/VP3/VP1 共表达可高产 PV3 sVLP（*毕赤酵母*表达体系）• 酵母表达的 PV3 sVLP 具有 D 抗原性并具热稳定性• PV3 sVLP 呈现紧凑的、类似病毒颗粒的构象• PV3 sVLP 在小鼠中诱导中和抗体的能力与 IPV 相当• 铝佐剂可显著增强 PV3 sVLP 的免疫原性引言脊髓灰质炎病毒（Poliovirus, PV）是一种小型、无包膜、正义链 RNA 病毒，属于小RNA病毒科（*Picornaviridae*）中的肠道病毒属（*Enterovirus*）（Kitamura 等，1981）。它是脊髓灰质炎（小儿麻痹症）的病原体，该疾病在历史上给全球公共卫生带来了巨大负担。PV 有三种抗原性不同的血清型（PV1、PV2 和 PV3），每一种都可引起麻痹性脊髓灰质炎，而保护力大多是血清型特异性的（Minor，2016）。自 1988 年全球消灭脊灰倡议（Global Polio Eradication Initiative, GPEI）启动以来，通过大规模疫苗接种运动取得了显著进展，使全球脊髓灰质炎发病率大幅下降。然而，野生型 PV，尤其是 PV1，仍在巴基斯坦、阿富汗等少数国家/地区呈地方性流行（Duizer 等，2017；Minor，2016）。目前获批上市的两类脊髓灰质炎疫苗——口服减毒活疫苗（OPV）和灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）——各有互补优势但也存在重要局限。OPV 能高度有效地诱导黏膜免疫并阻断病毒传播；然而其遗传不稳定性允许其回复突变恢复神经毒性，从而导致疫苗相关麻痹型脊髓灰质炎（VAPP）以及循环型疫苗衍生脊灰病毒（cVDPV）的出现，尤其在低免疫覆盖率人群中较为常见（Minor，2009）。IPV 可避免疫苗病毒复制，但在生产过程中需要进行感染性脊灰病毒的大规模培养，带来生物安全与防护方面的负担。这些限制促使人们开发新一代非复制性 PV 疫苗，该疫苗应能在不依赖活病毒培养的情况下呈现真实的中和表位。重组病毒样颗粒（VLP）提供了一种此类策略，因为它们可以模拟病毒颗粒的抗原性表面，同时又缺乏病毒 RNA，这已由获批上市的 HPV VLP 疫苗所证实（Roden 和 Stern，2018；Zhao 等，2022）。已有报道在重组表达系统中可以产生 PV 野生型毒株的 VLP（以下称 wtVLP）（Urakawa 等，1989），但其免疫原性较差，类似于天然存在的空衣壳（empty capsids, EC）（Rombaut 等，1994；Urakawa 等，1989）。PV 天然空衣壳，即所谓的 C 抗原，无法诱导保护性免疫反应；相反，PV 天然成熟病毒颗粒，即 D 抗原，可强效诱导中和抗体，并在体内发挥保护作用（Hogle 等，1985；Hummeler 和 Hamparian，1958；Mayer 等，1957）。因此，研究者投入大量努力设计并生产在结构和抗原性上类似于 PV 天然成熟病毒颗粒的 D 抗原性 VLP。2017 年，Fox 等在该领域取得了重大突破：他们鉴定出三个 PV 血清型衣壳亚基蛋白中的稳定化突变，从而能够产生具有 D 抗原性、热稳定且具有免疫原性的 EC（Fox 等，2017）。随后，这些稳定化突变被用于在多种重组表达系统中生产所有三个 PV 血清型的 D 抗原性热稳定 VLP（以下称 sVLP）（Bahar 等，2021；Hong 等，2024；Marsian 等，2017；Sherry 等，2022；Xu 等，2019）。尤其是 PV3 sVLP 已通过共表达突变型 P1 多聚蛋白与天然型或不可切割的病毒蛋白酶 3CD，在哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物和酵母中成功产生（Bahar 等，2021；Marsian 等，2017；Sherry 等，2025b；Sherry 等，2022；Xu 等，2019）。这些 PV3 sVLP 已在动物模型中被证明具有免疫原性（Bahar 等，2021；Marsian 等，2017；Sherry 等，2025b；Sherry 等，2022；Xu 等，2019），但其产量仍不理想，可能是因为 3CD 本身的内在毒性，以及/或 3CD 对 P1 加工效率不足，导致无法生成正确切割的 VP0、VP3 和 VP1 亚基（Hindiyeh 等，1999；Ypma-Wong 等，1988），这构成了成本效益型产品开发中的一个瓶颈。因此，寻找一种独立于 3CD、且能提高 PV3 sVLP 生产效率的表达策略，对于将该概念验证性疫苗候选物转化为真正的产品至关重要。在本研究中，我们设计了一种新型不依赖蛋白酶的表达策略：将 VP0、VP3 和 VP1 作为独立的衣壳亚基共表达（以下称 VP0/VP3/VP1），在*毕赤酵母*（*Pichia pastoris*）中进行表达，并将其与传统的 P1/3CD 共表达方式用于 PV3 wtVLP 和 sVLP 生产进行了比较。结果表明，VP0/VP3/VP1 策略可提高衣壳蛋白表达量并促进 VLP 组装。抗原性表征、冷冻电镜结构分析以及小鼠免疫学分析进一步证实，酵母表达的 PV3 sVLP（而非 wtVLP）具有 D 抗原性、病毒样构象，并在小鼠模型中可有效诱导中和抗体。这些发现为生产具有生物学活性的 PV3 sVLP 建立了一种高效且可扩展的生产策略，为基于 sVLP 的下一代脊灰疫苗的进一步工业化开发提供了支持。分章节片段细胞293T 细胞（国家细胞资源中心，上海，中国）在含 10% 胎牛血清（FBS）和 100 U/mL 青霉素-链霉素（Gibco）的杜尔贝科改良培养基（DMEM）中，于 37°C、5% CO? 条件下培养。Hep-2 细胞（ATCC）在含 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素-链霉素的 DMEM 中，于 37°C、5% CO? 条件下培养。PichiaPink? 酵母菌株（Invitrogen，美国）按厂商说明进行培养。抗体单克隆抗体 520……（后文未完）PV3 VLP 表达载体的构建与筛选在构建酵母表达载体时，对 PV3 野生型毒株（Saukett）及热稳定突变株（Saukett-SC8）（Fox 等，2017）的序列进行了密码子优化并合成。针对每个毒株构建了两种类型的载体：一种含 P1 和 3CD 两个表达盒，另一种含 VP0、VP3 和 VP1 三个表达盒（图 1a）。将每个载体分别转化入 PichiaPink? 酵母，并对转化子进行筛选……讨论尽管具有免疫原性的 PV3 sVLP 已在多种重组表达系统中成功生产，但其产量仍不理想，因此限制了其进一步开发。在本研究中，我们采用了一种独特的表达策略——共表达 VP0、VP3 和 VP1——在*毕赤酵母*（*P. pastoris*）中生产 PV3 sVLP。我们的结果显示，与传统的 P1/3CD 共表达方法相比，我们的 VP0/VP1/VP3 共表达策略提高了 PV3 sVLP 的产量……（后文未完）CRediT 作者贡献声明**Jiaqi Yao**：调查，数据整理。**Chaoyang Lian**：验证，数据整理。**Shuxia Wang**：方法学，调查，数据整理。**Cheng Lin**：调查，数据整理。**Yanqiu Zhou**：写作——审阅与编辑，指导，形式化分析，概念化。**Qingwei Liu**：资源，方法学。**Xiaoli Wang**：写作——审阅与编辑，指导，形式化分析，概念化。**Qin Hong**：写作——原稿撰写，调查，形式化分析，数据整理。**Wenyu Han**：写作……（后文未完）伦理声明本研究遵循 ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获得优树生命科学（上海）机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）批准（批准号：YS-m202311005）。伦理批准所有动物研究均在优树生命科学（上海）的动物设施内进行，并获得优树生命科学机构动物护理与使用委员会批准（批准号：YS-m202311005）。数据可用性冷冻电镜图谱已存入电子显微镜数据库（http://www.emdataresource.org），wtVLP 的登录号为 EMD-81997，sVLP 的登录号为 EMD-81988。相关结构模型已存入蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/），登录码分别为 43MU 和 43MI。利益冲突声明Wenyu Han、Chaoyang Lian、Qingwei Liu 和 Xiaoli Wang 目前是华松（上海）生物医药科技有限公司的员工。其他作者声明无利益冲突。资助本工作得到以下资助支持：国家自然科学基金委（32370991，授予 Z.H.）、国家重点研发计划（2024YFA1803102 和 2024YFA1306204，授予 Y.C.）、上海市科技重大专项（ZD2021CY001，授予 Z.H.）、中国科学院战略先导科技专项（XDB0570000，授予 Y.C.）、国家自然科学基金委（32130056 和 32570924，授予 Y.C.）以及中国科学院上海基础研究与探索计划（JCYJ-SHFY-2022-008，授予 Y.C.）。Q.H. 还获得……（后文未完）利益冲突声明Wenyu Han、Chaoyang Lian、Qingwei Liu 和 Xiaoli Wang 目前是华松（上海）生物医药科技有限公司的员工。其他作者声明无利益冲突。致谢我们感谢国家蛋白质科学（上海）中心电子显微镜设施以及数据库与计算设施的工作人员提供的仪器支持和技术帮助。作者列表：Tian Chen|Qin Hong|Wenyu Han|Shuxia Wang|Cheng Lin|Jiaqi Yao|Chaoyang Lian|Qingwei Liu|Xiaoli Wang|Yanqiu Zhou|Yao Cong|Zhong Huang