CTCF对齐单细胞类TAD结构域边界并稳定长距离活性染色质簇

《SCIENCE ADVANCES》：CTCF aligns single-cell TAD-like domain boundaries and stabilizes long-range active chromatin clusters

　　

CCCTC结合因子（CTCF）是三维（3D）基因组中的关键结构蛋白，但其丢失如何在单细胞分辨率下重塑染色质结构和转录仍不清楚。研究人员利用HiRES（同时分析同一细胞核的染色质接触和RNA）检测了CTCF耗竭的全基因组效应。单细胞中的拓扑关联结构域（TAD）样结构域（TLDs）在CTCF缺失后数量和大小基本保持不变，但其边界位置变得更加可变，伪批量分析显示A区室内部相互作用减少。研究人员还开发了SALTAFinder，用于识别空间聚集的长距离TLD组装体（SALTAs），即单细胞内共享三维空间的一组TLD。部分SALTAs富集高表达基因和超级增强子，并在CTCF耗竭后减少。这种结构重组与单细胞RNA输出的整体下降同时发生，HiRES和正交测量均证实了这一点。总之，这些发现表明CTCF有助于协调染色质组织和转录能力的调控，并与长距离活性染色质簇的稳定相关。

真核细胞的三维（3D）基因组为基因表达和染色质拓扑提供了基本调控框架。基因组被划分为A/B区室、拓扑关联结构域（topologically associating domain, TAD）和染色质环，这些层级结构约束了调控元件之间的通讯。CCCTC结合因子（CCCTC-binding factor, CTCF）通过序列特异性结合和方向依赖性阻断环挤压，锚定黏连蛋白（cohesin）介导的染色质环并界定TAD边界。然而，传统的群体Hi-C实验揭示CTCF缺失会导致TAD边界减弱或丢失、CTCF锚定环消失、TAD间接触增加，却掩盖了单细胞间染色质折叠的巨大异质性。单细胞Hi-C和染色质追踪成像显示，单个细胞核中的结构域边界位置和范围高度可变，这类结构被称为TAD样结构域（TAD-like domains, TLDs）。目前，CTCF缺失如何影响单细胞水平TLD边界定位和稳定性尚不清楚；并且在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中，CTCF降解仅影响少数基因表达，却显著降低分化潜能，因此CTCF缺失是否影响细胞整体的转录能力也是一个核心问题。

为解决这些问题，研究人员对CTCF-AID小鼠胚胎干细胞（mESCs）进行生长素（auxin）处理以耗竭CTCF，并利用HiRES技术在同一细胞核中同时分析染色质接触和RNA转录本，系统研究了CTCF丢失对基因组结构和转录的影响。结果表明，CTCF缺失并未消除单细胞中的TLD边界，而是使边界位置在不同细胞间的变异性增加；A区室内部相互作用减弱，同时每个细胞的RNA输出下降。研究人员还开发了SALTAFinder，用于识别空间聚集的长距离TLD组装体（spatially aggregated long-distance TLD assemblies, SALTAs），发现部分高活性SALTAs富含超级增强子和高表达基因，并在CTCF缺失后减少。该研究在单细胞水平上揭示了CTCF通过约束边界位置和稳定长距离活性染色质簇，协调染色质组织与转录能力，为理解三维基因组调控提供了新视角。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

研究人员采用的主要技术方法包括：使用CTCF-AID敲入mESCs（F1 Mus musculus castaneus × S129/SvJae，F123）作为实验系统，以auxin处理48小时诱导CTCF降解，未处理细胞作为对照；同时使用野生型R1 mESCs排除auxin的潜在脱靶效应。核心方法是HiRES，它结合原位Hi-C和RNA测序，从同一细胞核获得染色质接触图谱和转录组。通过质量控制，共获得668个高质量单细胞（344个CTCF缺失、324个对照）。利用Hi-C接触数据，使用Higashi软件识别单细胞TLD和区室分数，并用DeDoc2作为替代方法验证TLD识别。为识别高阶组装体，开发了SALTAFinder算法，基于加权接触网络和模块度最大化将染色体划分为包含至少三个TLD的模块。此外，还运用原位逆转录结合流式细胞术和果蝇RNA加标RNA-seq定量单细胞转录输出，并通过3D结构重建计算SALTAs的回旋半径（radius of gyration, Rg）。

**CTCF缺失后单细胞中TLD边界重新分布**

通过HiRES对668个高质量单细胞进行分析，研究人员发现伪批量Hi-C图谱重现了CTCF耗竭的经典效应，包括TAD增大、绝缘减弱和环强度降低。然而，单细胞层面TLD的数量和大小在CTCF缺失前后几乎不变（对照和缺失组分别约6640和6681个）。研究人员计算了每个50-kb片段作为TLD边界的概率（P_TLD-B），发现原本为群体TAD边界的片段在单细胞中平均只有约13%的概率被用作边界。CTCF缺失后，原TAD边界中心区域的P_TLD-B显著下降，而附近±100-400 kb区域的P_TLD-B上升，表明CTCF的作用不是维持域本身，而是约束边界在细胞间的相对位置。

**CTCF缺失后A区室相互作用减少和单细胞转录水平下降**

利用Higashi计算的单细胞区室分数显示，约78%的区室身份在CTCF缺失后保持不变，但A区室内部的观察/预期（observed/expected, O/E）接触频率显著降低，B区室内部略有增加。伪批量分析也发现类似改变，并在已发表的CTCF-AID数据集中得到重现。由于A区室富含活性基因和调控元件，这种区室内部相互作用减弱提示活性染色质组织松散。与此同时，HiRES的RNA数据显示CTCF缺失后每个细胞表达的基因数和RNA UMIs均减少。原位逆转录流式细胞术显示，CTCF缺失细胞核的RNA衍生荧光信号约为对照的75%；加标RNA-seq也显示其转录输出约为对照的91%，证明单细胞转录能力确实下降。

**SALTAFinder在单细胞中鉴定高阶TLD组装体**

为研究CTCF对高阶染色质结构的影响，研究人员开发了SALTAFinder，从单细胞Hi-C接触网络中识别由≥3个TLD组成的模块，定义为SALTAs。在对照mESCs中，每细胞平均有458个SALTAs，每个约含12个TLD，序列跨度约8.2 Mb，但线性基因组跨度约35 Mb。3D重建表明，SALTAs内TLD对的接触频率显著高于距离匹配的对照，且其Rg显著小于随机化对照，证实其为真实的空间聚集结构。SALTAs倾向于由相同区室身份的TLD组成，其中A-SALTAs显著富集高表达基因和超级增强子（super-enhancers, SEs）。

**CTCF对高活性SALTAs的稳定作用**

基于ChromHMM的12种染色质状态，研究人员将所有SALTAs分为7个聚类（C1-C7），其中C1-C3为活性SALTAs，C1具有最强的转录特征。CTCF缺失后，整体SALTAs的尺寸、跨度和所含TLD数量均增加，而最高活性的C1和C2 SALTAs比例下降，混合型或低活性类型比例上升。以含有超级增强子SE#1的位点为例，其属于C1/C2 SALTAs的比例从69.3%降至49.7%。在全基因组范围内，高表达基因若失去其TSS所在的活性SALTA环境，其表达下调幅度越大。在单细胞水平上，同一基因（如Polr2a）在其转录起始位点（transcription start site, TSS）位于C1/C2 SALTAs时的表达高于位于其外部时，而CTCF缺失导致该基因更常移入C2/C3 SALTAs，并伴随表达下降。这些结果表明活性SALTAs的稳定是CTCF维持高转录输出的重要结构基础。

在讨论部分，研究人员指出，他们的单细胞数据量化了群体TAD与单细胞TLD之间的关系：群体TAD边界实际上是一系列可能的单细胞边界位置中的概率极大值，其绝对使用频率并不高。CTCF缺失导致