《Cell Stress and Chaperones》：E4BP4 interacts with PERK to form a feedback loop mediating cold-induced female reproductive disorders
编辑推荐：
在研究人员此前的报道中，卵巢颗粒细胞中PERK/NRF2/CX43/StAR/孕酮通路的激活已被证明可介导冷诱导的雌性生殖障碍。然而，PERK如何被低温激活仍不清楚。本研究发现，昼夜节律蛋白E4BP4在暴露于寒冷或异丙肾上腺素（ISO，一种非选择性β-肾上腺素
在研究人员此前的报道中，卵巢颗粒细胞中PERK/NRF2/CX43/StAR/孕酮通路的激活已被证明可介导冷诱导的雌性生殖障碍。然而，PERK如何被低温激活仍不清楚。本研究发现，昼夜节律蛋白E4BP4在暴露于寒冷或异丙肾上腺素（ISO，一种非选择性β-肾上腺素能受体激动剂，可药理学激活β-肾上腺素能信号，该信号是冷应激反应的关键组成部分）后，在卵巢颗粒细胞中显著上调。机制上，E4BP4与PERK相互作用，并且是PERK激活及后续NRF2/CX43/StAR信号传导所必需的，从而导致孕酮分泌增加。有趣的是，在ISO处理下，NRF2也作为E4BP4的转录激活因子起作用，而阻断PERK或NRF2表达可减弱ISO诱导的E4BP4蓄积，提示存在涉及PERK/NRF2/E4BP4的正反馈环路。总之，这些发现将E4BP4鉴定为一种冷反应性昼夜节律蛋白，其与PERK相互作用，并可能通过双向E4BP4-PERK反馈环路促成冷诱导的雌性生殖障碍。
**研究背景**
气候变化与环境变化对女性生殖健康的影响日益成为全球性健康问题。温度是重要的授时因子（Zeitgeber），急慢性冷热暴露均可影响女性生殖系统，但既往研究多关注热暴露，冷暴露的生殖危害研究相对不足。随着在高海拔地区或南极等寒冷环境工作、旅行的女性人数增加，低温对生殖健康的影响亟需阐明。昼夜节律是生物体适应环境波动的内源性计时系统，在分子水平由多层转录-翻译反馈环路组成，其中E4BP4（NFIL3）是一种bZIP转录因子，既作为核心昼夜节律输出振荡器，也参与卵巢功能调节，例如在排卵前LH峰诱导下抑制颗粒细胞中排卵相关基因表达。研究人员此前已证明卵巢颗粒细胞中PERK/NRF2/CX43/StAR/孕酮通路的激活介导冷诱导的雌性生殖障碍，但低温如何激活PERK仍不清楚。本研究发表于《Cell Stress and Chaperones》，旨在鉴定冷敏感的昼夜节律蛋白并阐明其与PERK激活的关系。
**研究方法**
研究人员使用8周龄雌性C57BL/6小鼠（购自北京Charles River实验动物技术有限公司）作为在体模型，在4°C间歇冷暴露（每天4小时，持续3天）后收集动情间期卵巢组织；体外使用小鼠原代卵巢颗粒细胞（GCs）和KK1细胞系，以35°C温和低温培养或异丙肾上腺素（ISO）处理模拟冷应激的β-肾上腺素能信号。主要技术包括蛋白质印迹、免疫共沉淀、免疫荧光、RT-PCR、ELISA、siRNA敲低及质粒突变体回补等，用于检测蛋白表达、蛋白互作、亚细胞定位、mRNA水平及孕酮分泌。
**研究结果**
**1. 冷暴露通过E4BP4激活卵巢颗粒细胞PERK/NRF2/CX43通路并上调StAR依赖性孕酮**
研究人员通过Western blot发现，冷暴露小鼠卵巢中E4BP4蛋白显著升高，而CLOCK、BMAL1、CRY1、PER2等核心钟蛋白无明显变化；低温培养或ISO处理的原代GC中E4BP4同样升高，同时PERK和NRF2磷酸化增强、CX43上调。siRNA敲低E4BP4后，冷诱导的PERK/NRF2激活、CX43上调以及StAR依赖性孕酮分泌被显著抑制或完全阻断，说明E4BP4是冷诱导该通路激活及孕酮产生的必需介质。
**2. 冷暴露下E4BP4与PERK和p-PERK在卵巢颗粒细胞中相互作用**
通过双向免疫共沉淀，研究人员在冷暴露小鼠卵巢中检测到E4BP4与PERK及其磷酸化形式p-PERK的强相互作用。免疫荧光显示，ISO处理后E4BP4在核内明显蓄积，PERK由胞质转位至核内并与E4BP4共定位，p-PERK也在核内与E4BP4共定位。这表明E4BP4与PERK活化形式在核内形成复合物，参与冷应激信号传递。
**3. E4BP4与PERK的相互作用是冷诱导PERK/NRF2/CX43/StAR/孕酮通路激活所必需的**
研究人员构建PERK缺失突变体，发现E4BP4与野生型PERK及M1-M3突变体结合，但不与缺少N端激酶结构域的M4突变体结合；在PERK敲低细胞中，野生型PERK可回补ISO诱导的NRF2磷酸化、CX43和StAR上调及孕酮分泌，而结合缺陷突变体PERK-M4不能回补。反向实验中，E4BP4通过N端区域与PERK结合，结合缺陷突变体E4BP4-M2无法恢复E4BP4敲低导致的通路抑制。这些结果表明E4BP4-PERK直接互作对通路激活至关重要。
**4. 冷暴露下PERK/NRF2信号对E4BP4蓄积发挥正反馈作用**
冷暴露或ISO处理使E4BP4 mRNA水平升高，提示冷诱导的E4BP4上调发生在转录水平。启动子分析显示小鼠E4BP4启动子含有推定的NRF2反应元件（NRF2-RE）。敲低NRF2或PERK均能减弱ISO诱导的E4BP4 mRNA和蛋白表达，说明PERK/NRF2信号促进E4BP4转录，形成E4BP4→PERK/NRF2→E4BP4的正反馈环路。
**讨论与结论**
讨论部分指出，该研究的首要贡献是首次将昼夜节律蛋白E4BP4与PERK激活联系起来，使E4BP4成为感知冷刺激并启动PERK依赖性反应的应激传感器。其次，冷暴露下PERK发生核转位并与E4BP4互作，提示PERK存在非经典核内功能，E4BP4可能作为PERK的核内锚定伙伴。第三，E4BP4在应激卵巢中发挥非典型的正调控作用，有别于其在排卵中的转录抑制功能。第四，E4BP4的功能具有背景和刺激依赖性，冷应激下通过N端区域与PERK互作，而C端抑制结构域并非必需。第五，双向E4BP4-PERK-NRF2反馈环路可能将短暂冷刺激放大为持续细胞反应，但过度激活可能使适应性反应转向病理性生殖功能障碍；研究人员承认3天间歇
