综述：植物氮响应的分子基础及其潜在应用

《Current Plant Biology》：Molecular basis of Nitrogen response in plants and its potential applications

　　

氮素（N）被认为是植物中最为关键的常量营养元素之一。作物产量的提高在很大程度上依赖于适宜的氮素供应。多个基因和转录因子参与植物体内的氮代谢过程。非编码RNA（包括miRNAs、tasi-RNAs、长链非编码RNA）以及多种表观遗传调控因子在氮响应中发挥重要作用。近年来，基因组编辑技术（CRISPR/Cas9）及多种转基因策略已被广泛应用于提高植物的氮利用效率（NUE）。此外，微生物组与氮代谢的互作、气候适应性NUE作物培育、人工智能与大数据的整合也被应用于NUE研究中。

1. 引言
氮素（N）被认为是全球作物生产中最关键的常量营养元素之一，是作物产量的首要投入因子，因为产量的提高依赖于适宜的氮供应。绿色革命后，水稻、小麦、玉米、高粱、大麦等高产谷类作物的产量显著增加。植物在很大程度上依赖无机氮（N）的有效性，因为氮在叶绿素、核酸、蛋白质、纤维等关键分子的结构中发挥着重要作用。
地球大气中约78%为氮气，但由于其强大的三键特性，大多数生物无法直接利用。氮通过沉降和/或植物与微生物的固氮作用或闪电转化为生物可利用形式。通过沉降过程，植物可直接同化来自大气的一氧化氮（NO-）、亚硝酸盐（NO-2）、硝酸盐（NO-3）、氨（NH+3）、硝酸（HNO-3）以供生长，而动物则通过取食植物获得所需氮素。在固氮过程中，大气中的氮通过共生作用在豆科植物根瘤中转化为NO-2、NO-3和NH+3。一旦固定，氮进入土壤，被土壤微生物转化为铵（NH4+）和硝酸盐（NO3-），植物通过根系吸收这些形态，这一过程称为土壤吸收。
农民每年在全球范围内为谷类作物施用大量氮肥（2021年约1.192亿吨），不幸的是，谷类作物仅能吸收施氮总量的不到40%，其余部分因淋溶、地表径流、挥发的气态损失和微生物消耗而流失到环境中。过量氮素造成空气和水污染，并对土壤健康与生物多样性产生巨大影响。农业土壤中的氮径流进入水体显著加剧了水体污染，导致藻类过度繁殖，进而降低水中溶解氧水平，影响水生生物。此外，氮可利用性的失衡可能导致食物网动态和水生生物多样性的改变。为减少环境中的氮排放，必须充分认识全球变暖对氮循环、水质及生态系统整体健康的不利影响。为此，需要制定相应的适应策略，关键策略包括提高作物品种的氮利用效率（NUE）、采用可持续农业实践，以及改进和调整现行政策与法规，以有效管理氮排放并获得改良作物品种。

1.1 作物中氮的利用过程
硝酸盐（NO?3）被认为是多种氮形态中的关键来源，大多数作物以硝酸盐为氮源，而水稻则偏好从土壤中吸收铵（NH+4）形态。通常情况下，农业土壤中硝酸盐的可获得性相当有限。因此，作为一种固着生物，植物必须迅速适应动态变化的氮浓度环境以促进其氮代谢。因此，了解氮的利用过程及其调控机制至关重要，这将有助于进一步提高植物利用和调控外加氮肥的能力。植物中氮的利用过程包括多个阶段，如氮吸收、还原、同化、再活化与转运。谷类作物中，单位土壤有效氮所产生的籽粒产量被定义为氮利用效率（NUE）。然而，作物NUE是植物捕获氮的效率（吸收效率）与利用已吸收氮的效率（利用效率）之间的良好整合。大多数植物包含两种硝酸盐吸收系统及相关转运蛋白基因：其一是高亲和力转运系统（HATS），适用于外部硝酸盐浓度低于0.5 mM时；其二是低亲和力转运系统（LATS），适用于硝酸盐浓度高于0.5 mM时。

1.2 氮的吸收与转运
植物中已报道有四个家族的转运蛋白基因参与氮吸收与转运的调控：硝酸盐转运蛋白1（NRT1）/肽转运蛋白（NPF）家族、氯离子通道（CLC）家族、硝酸盐转运蛋白2（NRT2）家族以及慢阴离子通道相关同源物（SLC/SLAH）家族，分别包含约53个NPF、7个CLC、7个NRT2和5个SLAC/SLAH基因。低亲和力转运蛋白主要属于NRT1家族，而NRT2/NRT3（NAR2）基因则作为高亲和力转运蛋白。植物中仅鉴定出8个NRT2转运蛋白；其中拟南芥中有7个NRT2基因被鉴定。NRT2.1、2.2、2.4和2.5这四个基因与根部硝酸盐内流相关。NRT2.1在硝酸盐饥饿条件下表达，在高硝酸盐条件下则被下调，因此NRT2.1被认为是HATS的主要硝酸盐调控组分。水稻中有四个高亲和力NRT2家族成员被报道。最近研究表明，在水稻中过表达硝酸盐转运蛋白基因OsNRT2.3b可通过改善pH缓冲能力显著提高籽粒产量和NUE。拟南芥NRT2家族与OsNRT2.3和OsNRT2.4密切相关。最近通过RNA-seq分析，在甘蓝型油菜中鉴定出17个NRT2基因；在普通小麦中发现了16个与拟南芥NPF同源的低亲和力NPF（NRT1）基因。水稻中的铵转运蛋白已被有效鉴定，迄今共鉴定出10个AMT基因家族成员；其中3个OsAMT1家族成员被指定为HATs，其余3个OsAMT3、1个OsAMT4和3个OsAMT2成员则被称为LATS。在拟南芥中，有5个AMT类转运蛋白基因在根部表达，均在氮缺乏条件下被正调控。其中，AMT1-1、1-2和1-3被鉴定为NH4+的HATs，而AMT2-1及其他成员被认为是NH4+的LATs。

1.3 氮的还原与同化
硝酸盐被吸收到根部后，首先在细胞质中由硝酸还原酶（NR）转化为亚硝酸盐，然后进入质体，最终在亚硝酸还原酶（NiR）的作用下转化为铵。拟南芥中有两个NR基因（NIA1、NIA2）。在氮同化和再活化过程中，关键酶谷氨酰胺合成酶（GS）与谷氨酸合酶（GOGAT）共同构成GS-GOGAT循环，通过转化无机铵形成谷氨酰胺。目前已已知GS有两种同工型：胞质型GS1和质体型GS2，分别负责根系组织中的关键铵同化或叶片组织中蛋白质周转过程中的铵再同化，而GS2负责叶绿体中光呼吸产生的铵同化。GS由一个包含至少3-5个成员的小基因家族编码。在拟南芥叶片衰老过程中，GLN1;2、1;1和1;4发挥重要作用。GLN1;1位于根尖、根毛和根表面；GLN1;2局限于维管组织并受铵正调控；GLN1;3也位于维管组织，但其表达局限于根成熟区；GLN1;4仅在侧根发生的基部区域表达。研究表明，在硝酸盐充足条件下，拟南芥gln1;2突变体表现出莲座生物量减少、GS活性降低、铵浓度升高，且在单一铵条件下产生更长的根毛和更高的铵浓度。水稻中GS家族共有三个成员，即OsGS1;1、1;2和1;3，其中前两个在所有器官中几乎均表达，第三个则特异性地在小穗中表达，其功能是参与成熟种子中的铵同化。迄今报道的GOGAT有两种类型，一种依赖于铁氧还蛋白（Fd-GOGAT），另一种依赖于NADH（NADH-GOGAT），二者在电子供体特异性上存在差异。

1.4 氮的转运与再活化
氮再活化是提高作物NUE的重要过程，包括在营养生长阶段氮从衰老器官向幼嫩器官的转运，或在生殖阶段向储藏部位的转运。根据氮再活化速率和总氮再活化效率可以推断，营养器官再活化的氮是籽粒总氮的约60%-92%的重要来源。在水稻中，80%的氮转运发生在衰老器官向稻穗的转运过程中。为提高氮再活化效率，衰老调控的蛋白质降解与氮再活化之间需要精细协调，因为衰老的启动会激活氮向生殖器官的转运。研究表明GS1.1和NADHGOGAT1在这一氮向生殖器官转运过程中发挥关键作用。据报道，延缓叶片衰老实际上可提高籽粒产量，因为延长的光合作用持续时间可产生更多的光合产物，从而最终提高籽粒产量。此外，这种延长会降低氮再活化速率，进而降低籽粒氮含量。在成熟或胁迫期间，由于植物氮吸收减少，氮从叶片和茎向种子的再活化变得必不可少，最终导致叶片衰老。在此情况下，调控叶绿体降解和蛋白酶的相关基因被上调。在养分有限的条件下，这是一种有效的植物生存机制，直接影响氮利用效率（NUE）和作物产量。因此，叶片衰老被称为高度有序的“程序性死亡”过程，通过在叶片死亡前回收养分而对提高NUE至关重要。蛋白激酶和磷酸酶等调控蛋白以及WRKY、NAC、MYB、AP2/ERF、bZIP等多个转录因子是叶片衰老和干旱胁迫的关键调控因子。其他参与水稻和小麦氮再活化的基因包括TaNAM-B1、TaNAC-S、TaATG8、OsNAC、OsATG8、OsNRT2.3、OsGS1-1。

1.5 氮利用效率的植物育种
单位氮肥施用量所获得的经济效益也称为NUE，它是氮吸收效率（NUpE）和相应的氮利用效率（NUtE）共同作用的结果。生物量、产量和籽粒品质的提高可改善作物经济效益，进一步表明NUE的改善。作为合成肥料，主要施用10 N，而一小部分氮来自豆科作物固氮作用。植物通过根系以硝酸盐（NO?3）或铵（NH4+）的形式吸收氮，并进一步用于完成代谢过程。由于氮具有移动性，其从土壤中的损失高于任何其他元素。此外，作物种类在氮吸收能力方面也可能存在差异。根据土壤类型、植物群体和环境条件，植物仅能利用所施氮素的约30%-50%。最近观察到，全球24%-39%的玉米、水稻、小麦和大豆种植面积已被证明处于产量停滞状态。因此，补充氮肥施用以提高作物NUE对于实现更高产量并减少过量氮对环境和生产成本的损害至关重要。迄今为止，多个研究团队主要通过植物育种技术（经典方法）而非遗传水平的分子技术培育出了具有增强NUE的种质资源。基因组编辑技术（GET）作为一种新型植物育种技术（NPBT），是一种高效、多功能、成本低廉且同样可靠的工具，已被全球研究人员广泛采用，可用于开发氮高效利用的水稻基因型。其在产生所需表型遗传修饰方面的高效性、高精度、适宜性和及时性提升了其在研究中的受欢迎程度。经典的GET和传统植物育种工具不足以满足这一巨大需求。这些NPBT包括成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白（CRISPR/Cas）、引物编辑（PE）、碱基编辑（BE）和CRISPR-CRISPR来自普雷沃氏菌和弗朗西斯氏菌1（Cpf1）。已发现利用这些GET可以成功实现作物的目标表型。此外，NPBT能够产生不含外源基因的转基因-free植物，这些植物被视为非转基因（GM）作物，从而缓解了GM作物严格监管框架的限制。土壤中动态的氮可利用性与作物产量之间存在强相关性，这使育种者能够适应养分丰富的土壤。全球科学家正在低氮或缺氮条件下选择具有高产量效率的杂交种/基因型，以改善粮食生产。美国绿色革命之父Norman Borlaug早期培育了半矮秆、高产且抗病的小麦品种，这是选择能够高效利用氮的植物的传统方法。Rht-B1和Rht-D1基因被称为矮化基因，来源于美国高产品种（Brevor）与日本矮秆小麦品种（Norin 10）的杂交。利用这些矮化基因已成为一种模式，以提供能够利用过量氮肥且不发生倒伏的植物，而倒伏在高秆品种中常见。赤霉素（GA）敏感的Rht-B1和Rht-D1基因编码DELLA蛋白的突变形式，存在于大多数现代小麦品种中，它们改变了茎的坚固性和植株结构，最终在高肥条件下产生更高产的植物，从而提高了NUE。为避免转基因监管问题，新型植物育种技术（NPBT）是理想选择，它们确定、快速且可应用于多种植物物种。在植物功能基因组学中，利用核酸内切酶进行基因组编辑是全球应用最广泛的工具。一种基于CRISPR/Cas9大鼠胞苷脱氨酶（APOBEC1）的碱基编辑（BE）系统已被成功用于诱导水稻中两个重要基因NRT1.1B和SLR1的定点突变，这两个基因也是农业上至关重要的基因。NRT1.1B编码一种氮转运蛋白，根据早前报道，该基因中的C/T替换（Thr327Met）可提高水稻NUE。SLR1编码DELLA蛋白，其TVHYNP基序内或附近的氨基酸替换可导致株高降低。基因组编辑技术（GET）的恰当应用在提高水稻及其他作物NUE方面具有巨大潜力。当前可用的基因组学数据将被进一步利用以获得所需的表型操作，从而促进更可接受的农业可持续发展。

1.6 氮利用效率数量性状位点的定位
QTL检测取决于多个因素，如定位群体、环境、基因组覆盖度和所研究的性状。大多数数量性状由少数主效QTL和许多具有加性效应的微效QTL共同控制。全球研究人员已在大量植物物种中开展了氮高效性状的定位工作。在水稻的一项此类研究中，研究者调查了与NUE相关的QTL及其可能通过NADH-GOGAT和谷氨酰胺合成酶1（GS1）共分离的调控机制。作为水稻和小麦的农艺性状，大量与产量和氮利用相关的QTL被定位到含有GS2的染色体区域。这些报道表明，GS2附近的基因组区域将是培育农艺性能和NUE增强的小麦和水稻品种的潜在候选区域。尽管迄今为止我们尚不清楚如果将GS基因引入氮低效背景中是否会发生NUE和产量的提高。研究人员利用全基因组关联作图鉴定了与大麦中与NUE相关的生物量和籽粒产量等多个性状相关的基因。另一项针对329份冬大麦基因型的全基因组关联研究（GWAS）定位了与NUE相关关键农艺性状相关的标记，并发现了两个在不同年份和环境中稳定的QTL。另有研究通过条件分析证明了N和P施肥对小麦重组自交系（RIL）群体QTL的影响。与籽粒和茎秆氮浓度及NUtE性状相关的QTL受N处理影响，而每穗小穗数的QTL受P处理影响。通过全基因组关联（WGA）作图，在196份小麦材料中鉴定出与籽粒产量及其构成因素和其他性状相关的共54个基因组区域。该研究还揭示了分布在16条染色体上的23个基因组区域对N有响应，可作为小麦育种计划中改良氮响应性的潜在候选区域。在玉米中，多项研究利用分离群体定位了与NUE相关的QTL。另一项研究对正常和低氮条件下的产量及其构成因素的QTL进行了meta分析，鉴定出一定数量的meta-QTL，并根据置信区间、图谱位置和表型变异百分比进行了分类。该meta分析在低氮条件下鉴定出22个QTL，其中在3、5、6和9号染色体上发现2个一致QTL，在2号染色体上发现3个，在1号和4号染色体上发现4个。大麦和小麦中有一组QTL同时影响NUE和籽粒蛋白含量（GPC）。Gpc-B1位点影响小麦和大麦中的氮再分配，从而导致植株内氮分配和NUE的重大差异。在澳大利亚品种中，近等基因系（NILs）中的Gpc-B1表现出GPC提高而对籽粒产量无不利影响。然而，GPC对大麦和小麦品质均有显著影响。因此，在不损害籽粒产量的情况下提高GPC是非常迫切的；此外，一些QTL，如2A和1B染色体上鉴定的GPC相关QTL，可能是实现此目的的良好候选者。

1.7 调控谷类作物氮利用的转录因子
转录因子被认为是植物多个调控网络中的主要调控因子之一，并对氮利用极为重要。拟南芥中的MADS box转录因子ANR1在响应硝酸盐信号的侧根形成中发挥重要作用，并作为NRT1.1信号通路中的调控因子。另一个调控多个硝酸盐转运蛋白基因的关键转录因子是NLP（NIN-like protein）基因家族。另一个转录因子TCP20（Teosinte branched1/Cycloidea/Proliferating cell factor1-20）调控硝酸盐响应中的侧根形成，NRG2（硝酸盐调控基因）与NLP基因相互作用。研究表明OsNLP1上调NH4和NO3吸收及同化相关的转录因子。另一个研究组发现OsNLP4作为该家族中NUE的主调控转录因子，在微调大多数氮信号和利用相关基因方面发挥关键作用。单指DNA结合（DOF）蛋白是植物转录因子，在植物生长发育中具有多种功能，如激素信号传导、组织分化等。在水稻中，转玉米DOF1（ZmDOF1）基因的表达在低氮条件下增强了氮同化和植物生长。同一基因被转入高粱和面包小麦后，这些物种的生物量积累下降。最近报道了osDOF18基因调控水稻根中铵转运蛋白家族成员AMT1、2、3的铵吸收基因。转录组分析研究表明，当成熟硬粒小麦暴露于氮饥饿环境时，与对照相比，氮胁迫处理植株根中DOF1.3基因表达上调。同一研究组发现了170个编码属于不同基因家族转录因子的独特基因，包括WRKY、NAC、NF-Y、C2C2-Dof、MYB、bZIP、bHLH、ARF和IAA/AUX及mTERF等。这些基因中的大多数和其他已报道基因是一些发育重要miRNA的靶标转录因子。这些基因在氮胁迫条件下与硬粒小麦对照相比表现出差异表达。另一项研究报告称，钙依赖性蛋白激酶12（CPK12）的过表达在低氮胁迫条件下导致水稻植株生物量显著增加。NAC超家族是最大的植物特异性转录因子家族之一。小麦中的TaNAC2-5A能够结合氮转运和同化基因的启动子区域。当该基因在小麦中过表达时，在低氮处理下籽粒和产量氮含量显著增加。研究表明NAC7基因与玉米氮代谢相关，该基因的RNAi抑制系在玉米中表现出深绿色表型。转录组分析揭示NAC7通过调节光合作用、蛋白质周转和海藻糖-6-磷酸途径基因，在玉米中充当绿色性状的下调调控因子。研究表明，小麦中过表达TabZIP60基因会降低小麦产量，主要由于穗数减少。RNAi抑制系中发现了相反效果，产量显著增加。TabZIP60通过结合TaNADH-GOGAT-3B基因启动子的调控区域负调控该基因。另一个转录因子DELLA通过抑制氮同化而降低NUE。生长调控因子4（GRF4）与生长抑制因子DELLA相互作用，提供碳氮代谢和生长的联合稳态调控。GRF4的上调可在不干扰有利半矮化性状的情况下提高NUE和产量。另一项研究发现转录因子GRF4可通过调控MYB61来控制氮利用，MYB61的等位基因在两个水稻品种（粳稻和籼稻）中存在差异。在籼稻和粳稻背景下通过CRISPR/Cas9对GRF4和MYB61进行突变表明，与粳稻等位基因相比，籼稻MYB61等位基因促进强转录，在较低的氮供应条件下产生更高的NUE和籽粒产量。另一项近期研究表明OsNLP1上调调控NO3和NH4吸收及同化相关基因的表达。研究发现该家族中的另一个转录因子OsNLP4是NUE的主调控因子，协调参与氮信号和利用的广泛基因。通过使用一种称为判别性局部子空间的机器学习算法的meta分析识别出其他参与氮吸收的转录因子，鉴定出BT1（Bric-a-Brac/Tramtrack/Broad基因家族）和BT2作为硝酸盐响应网络中的枢纽基因。功能分析表明这些基因在拟南芥中作用于下调硝酸盐吸收和NUE基因，这种调控在水稻BT直系同源物中也被发现。

1.8 植物氮响应中的小非编码RNA
近几十年来，一类非编码RNA（ncRNA）——小RNA（sRNAs）已被证明可调控靶基因，通常通过转录本切割或翻译抑制实现。根据结构、生物发生和功能，已报道了几类sRNA。两类重要的植物sRNA——microRNAs（miRNAs）和反式作用小干扰RNA（ta-siRNA），长度为19-22个核苷酸，通过负调控靶基因表达来调节植物生长、发育和生理的多个方面。随着下一代测序（NGS）和功能基因组学的进展，研究人员已鉴定出在不同氮可利用性条件下差异表达的小RNA，这表明sRNA在氮可利用性介导的植物响应中具有潜在作用，此外还存在各种蛋白编码基因的调控。

1.9 miRNAs在氮响应中的作用
MicroRNAs（miRNAs）是长度为21-24个核苷酸的小型非编码RNA，通过转录切割或翻译抑制控制其靶标转录因子。因此，它可以调节植物生长和发育过程的不同方面，包括多种非生物和生物胁迫以及包括硝酸盐在内的营养响应。迄今为止，全球多个研究团队已在多种作物上进行了大量基于测序和计算分析的研究，重点是鉴定参与缺氮响应的miRNAs。研究表明，在缺氮植株和补氮植株及其各自对照中，有100多个保守miRNAs差异表达（DE）。根据近期研究，在玉米、水稻、小麦以及模式植物拟南芥等多种作物中，以下miRNAs参与缺氮条件：miR169、miR398、miR395、miR171、miR159、miR408、miR528、miR393、miR167、miR168、miR164、miR826、miR5090、miR399、miR820、miR1118、miR1129、miR1136、miR1133、miR2275。miR169家族成员已被鉴定为在缺氮条件下调控关键的氮转运蛋白靶基因。miR169在拟南芥中通过结合其启动子调控区域靶向转录因子NF-YA（Nuclear Factor YA），并控制硝酸盐转运蛋白基因AtNRT2.1/AtNRT1.1。在氮缺乏条件下，miR169在拟南芥的茎和根组织中均高度下调，而其靶基因NFYA上调。miR169a的过表达下调NF-YA表达，并诱导植物产生与NRT1.1和NRT2.1抑制相关的氮饥饿超敏反应，表明miR169在氮再活化和吸收中具有重要功能。在玉米中，缺氮植株中miR169下调。在面包小麦中，缺氮条件下靶基因NF-YA正调控被观察到，而在小麦中过表达TaNFYA-B1可触发硝酸盐转运蛋白基因表达、侧根分支增多，并在缺氮条件下提高籽粒产量和氮吸收能力。miR167是另一个重要的miRNA，通过调控两个靶标——生长素响应因子ARF6和ARF8参与硝酸盐胁迫下侧根的生长。另一个发育重要且受硝酸盐诱导的miRNA是miR393，通过其靶标生长素受体AFB3调控根系中的硝酸盐响应。miR393/AFB3模块通过硝酸盐响应调节拟南芥中的根系结构（RSA）。另一个发育重要的miRNA——miR164在低硝酸盐条件下上调，其靶标NAC转录本的抑制已被发现。有趣的是，在玉米叶片中，低氮处理后zma-miR164下调。在水稻低氮条件下的miRNA微阵列表达分析研究中，32个miRNA的表达显著改变，其中6个miRNA（miR164、miR156、miR820、miR528、miR1318和miR821）在叶片中发现，4个miRNA（miR167、miR164、miR528和miR168）在根中发现。另一项研究表明，在缺氮条件下，玉米叶片、根和幼苗中的miR528家族成员被抑制。此外，miR528被报道通过减少生长素信号参与水稻腋芽中氮介导的分蘖。在氮饥饿条件下，普通小麦中miR1118、miR1129和miR1136三个miRNA高表达。有趣的是，在这种条件下根中miR1133下调。在氮饥饿条件下普通小麦中miR2275上调，而在氮恢复处理下该miRNA表达逐渐恢复。miR2275的过表达产生氮积累和生物量增强的植株。相对较年轻和新颖的miRNAs miR826和miR5090的表达也在氮缺乏条件下受到影响，导致其靶标ALKENYL HYDROXALKYL PRODUCING2（AOP2）下调，该基因调控硫代葡萄糖苷生物合成途径。包含AOP2的基因组区域内的反向重复可能进化出这两个miRNAs，表明它们对氮缺乏响应的适应和AOP2的共进化。在拟南芥中过表达这两个miRNAs产生了有趣的结果，包括更多侧根、植株对氮饥饿耐受性增加、生物量增加、NRT2.1表达增加以及叶绿素含量增加和花青素水平降低。

1.10 ta-siRNAs在氮响应中的作用
TAS3是被称为tasiARFs的tasiRNAs的前体，靶向ARF2、3和4。miR390是一个进化上保守的miRNA，结合并切割TAS3转录本，触发tasiARF的产生。在拟南芥中，生长素介导的miR390/TAS3/ARF模块调控侧根（LR）的形成。目前，通过RNA-seq分析报道，在极度缺氮条件下TAS3表达显著下调。由于TAS3上调LR生长，该研究团队假设缺氮条件下TAS3的下调正调控ARFs，因此观察到LR生长的抑制。有趣的是，ARF2-4尤其是ARF4的表达在缺氮条件下增加，而TAS3的过表达降低了ARF4的表达，从而在严重缺氮条件下促进LR生长的显著增加。他们通过计算发现了来自TAS3的小RNA与NRT2.4转录本之间的联系，并通过cDNA末端快速扩增推断TAS3依赖性切割NRT2.4转录本。此前，NRT1.1促进的生长素转运以及CLE-CLV1肽信号通路已被报道并很好地阐明了显著缺氮条件下LR形成的抑制机制。由于ta-siRNA生物发生需要特定的miRNA功能，因此植物营养响应中miRNAs、ta-siRNAs及其靶标之间很可能存在串扰。

1.11 长链非编码RNA（lncRNAs）在氮响应中的作用
调控性ncRNA有两种类型：小ncRNA和长ncRNA。小ncRNA进一步分为microRNAs（miRNAs）和小干扰RNAs（ta-siRNAs），如上所述。而长ncRNAs（lncRNAs，通常>200 nt）不具备编码蛋白质序列的能力。利用RNA测序数据库可以获得氮响应的lncRNAs档案。根据一项研究，在分析10 mM KNO3处理2小时的7天龄拟南芥根转录组数据后，共发现695个lncRNAs，其中7个上调，1个下调。另一个研究团队在分析拟南芥根在N、P、K、Fe、S、Ca、Mg、B、Zn、Cu、Mn和Mo等多种营养饥饿条件下处理4天的转录组数据后，鉴定出60个差异表达（DE）的lncRNAs，其中在缺氮条件下15个下调和6个上调。研究进一步报道，其中AT1G11185、AT1G67105和TAS3这21个lncRNAs中的3个也对氮胁迫有响应。他们进一步通过生物信息学流程鉴定了多个lncRNAs，并报道了数百个lncRNA-mRNA对之间的高分子相互作用潜力，发现其表达模式高度相关。AT1G67105靶向铵转运蛋白基因AMT1;2。在缺氮条件下，AMT1;2正调控而AT1G67105负调控，表明AT1G67105在铵吸收调控中的潜在作用。这些发现将有助于进一步鉴定和研究更多lncRNAs及其在缺氮或氮缺乏条件下的靶基因。在玉米中，通过RNA-seq分析在氮充足和缺氮条件下鉴定了7245个lncRNAs。共表达分析研究表明，大多数lncRNAs参与调控氧化磷酸化、氮化合物代谢事件和NADH脱氢酶活性的能量代谢途径。然而，lncRNAs的精确作用仍有待理解。另一个研究团队在杨树缺氮条件下鉴定出126个DE lncRNAs，并将其分为反义lncRNAs、pri-miRNAs和miRNA靶标。这些鉴定结果将有助于进一步鉴定和表征更多lncRNAs及其靶基因在植物多种氮胁迫条件下的功能作用。

1.12 整合组学方法鉴定氮响应基因
植物科学中的多组学研究技术，包括蛋白质组学、转录组学、基因组学等，有潜力揭示植物响应氮胁迫的转录、转录后、翻译和翻译后机制的复杂调控网络。它还有助于揭示分子表型，提供对调控生物过程、分子功能、细胞相互作用（无论是体内还是体外）的见解。

1.13 蛋白质组学方法
近年来，作为全局基因表达分析和蛋白质鉴定的工具，蛋白质组学方法已成为植物研究领域中一种资源丰富的工具。为研究水稻根系对低氮胁迫的响应，采用了两种低氮处理（0.14 mM NH4NO3和1.07 mM NH4NO3）。低氮条件下RSA表现出显著变化，不定根下部出现更多侧根，上部出现更长的侧根。对低氮处理植株根部蛋白质谱进行2D凝胶电泳分析，揭示了蛋白质的差异表达，并通过质谱进一步分析蛋白质。结果涉及12个蛋白质斑点，其中11个功能已知。另一项研究表明，在不同氮条件下，玉米（爆裂玉米）两个对比自交系中发生蛋白质组变化。他们在玉米两个不同自交系中在两种氮胁迫（低氮和高氮）条件下进行了蛋白质组分析。通过比较蛋白质组分析，在低/高氮胁迫下分别鉴定了两个玉米自交系中的79个和96个差异积累蛋白（DAPs）。在两种氮条件下，一个品系的氮吸收效率和NUE增加，而另一个品系则降低。与碳水化合物和能量代谢相关的DAPs表明氮控制来自替代途径的酶以适应能量短缺。他们还报道果糖-二磷酸醛缩酶可能在P2（其中一个自交系）中充当重要的硝酸盐响应蛋白。参与氮代谢和抗坏血酸生物合成的蛋白质在P2中上调，Fd-NiR和L-抗坏血酸过氧化物酶之间的相互连接可能在NUE性状中发挥关键作用。在小麦中，缺氮可促进初生根伸长以深入土壤满足氮吸收。在低氮条件下对两个小麦品种根部进行了基于iTRAQ的比较蛋白质组学研究。他们鉴定了84个与低氮促进的初生根生长过程特异性相关的差异丰度蛋白，并发现11条途径显著富集。脂质和谷胱甘肽代谢以及内吞作用和苯丙烷生物合成途径可能在调控低氮控制的初生根生长中发挥关键作用。在拟南芥中，在硝酸盐缺乏和恢复阶段采用了基于2D凝胶的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学方法。7天龄拟南芥幼苗在氮缺乏条件下处理48小时，然后恢复24小时。他们分别鉴定了170个和38个丰度和磷酸化状态发生显著变化的蛋白质。通过生物信息学分析表明，这些蛋白质参与多种细胞过程，包括光合作用、氧化还原稳态、蛋白质代谢和信号转导等。

1.14 代谢组学方法
代谢组学是一种全面的生物化学方法，有利于研究氮代谢，因为代谢物可以在多种氮条件下直接和/或间接协调转录本和蛋白质水平。在近期的一些水稻研究中，通过氮响应微阵列数据鉴定了1,064个NUE相关基因。他们通过分层方法进一步筛选出62个候选基因，包括QTL共定位和蛋白质-蛋白质相互作用。这些基因定位于1、3、5和9号染色体，其中1号染色体上的26个基因被确定为跨越该染色体81%的NUE热点区域。进一步的蛋白质-蛋白质相互作用分析揭示，这些基因参与多种NUE相关过程，如代谢、光合作用、水分缺乏、发育、转运、氧化还原、转录、磷酸化、激素和保卫细胞功能等。另一研究团队通过GC-MS分析番茄，报道硝酸盐缺乏对叶片代谢具有全面影响，减少了多种有机酸和氨基酸，随后增强了多种碳水化合物、磷酸酯以及若干次生代谢物。另一项研究在玉米中进行，利用1H-NMR波谱在玉米籽粒灌浆期进行代谢谱分析，以研究谷氨酰胺合成酶（GS）突变对叶片的生理效应，观察到氮从茎秆到籽粒的再动员输出。在两个功能性胞质谷氨酰胺合成酶（GS）同工酶GS1.3和GS1.4基因表达缺陷的玉米突变体中，分别表现出籽粒数和籽粒大小减少。在双突变体中突变效应增强。有趣的是，在成熟期所有突变体的茎秆生物量积累均未改变，表明酶催化反应明确参与籽粒产量调控。在三个GS突变体中发现多种含氮代谢物（如苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和磷脂酰胆碱）的含量增加。此外，该研究报道了酪氨酸和苯丙氨酸这两种代谢物的集合，它们参与苯丙烷途径的初始步骤。在拟南芥中，研究表明FUM2是叶片中富马酸积累所必需的，而富马酸积累对于高浓度氮条件下的快速氮同化和生长至关重要。

1.15 转录组学方法
迄今为止，已有多项研究调查了多种作物物种在多种氮处理下的全基因组基因表达。近年来，大规模并行DNA测序技术推动的转录组测序（RNA-seq）已发展成为一种重要工具，因其更高的可重复性和分辨率而取代了微阵列技术。在最近的一项研究中，通过微阵列分析，在氮饥饿12小时后鉴定出1,650个差异表达基因。在氮充足和氮缺乏条件下12小时后，研究人员利用水稻根和叶鞘两种组织构建了cDNA文库，并在分析测序文库后发现了共33,782个注释基因。丰度比较分析鉴定了1,650个因缺氮而差异表达的转录本。其中，共有1,158个基因在叶鞘中差异表达（548个上调，610个下调），492个在根中差异表达（276个上调，216个下调）。在通过RNA-Seq分析鉴定的前36个缺氮响应基因中，有34个后来通过定量RT-PCR分析得到确认。RNA-seq数据揭示了8,509个多外显子基因，包括19,628个选择性剪接事件。在缺氮和氮充足条件之间未观察到选择性剪接的显著差异。该研究团队鉴定了2,986个新转录本，其中192个受缺氮调控。另一项研究通过cDNA-扩增片段长度多态性（AFLP）衍生转录本分析，在玉米（幼苗）根系在多种硝酸盐条件下鉴定了661个差异调控转录本。通过qRT-PCR和原位杂交对选定基因进行表达分析。结果表明根表皮细胞中特定基因的共调控转录模式与一氧化氮清除相关。他们的发现加强了对玉米硝酸盐响应中油菜素内酯（BRI1）已知机制的认识，即MKK2-MAPK6模块以及通过清除（血红蛋白）和合成（硝酸还原酶）组分的共表达实现一氧化氮稳态的同步协调。在大豆中，一项研究在氮限制条件下对两个大豆品种进行了Solexa测序以鉴定NUE基因。总体而言，该研究鉴定了22条信号转导和代谢途径中涉及的3,231个基因被正调控或负调控。随机选择24个基因通过qRT-PCR方法进行进一步验证。另一项在硬粒小麦中的研究通过RNA-seq分析，在籽粒灌浆期间对叶片/茎、根、穗和旗叶响应长期氮饥饿共鉴定了4,626个差异表达基因（DEGs）。转录水平变化最大的出现在根中，有3,270个DEGs；而在叶片/茎、旗叶和穗组织中分别鉴定了963、470和355个DE基因。共发现799个基因本体（GO）术语，其中分别有180个正调控和619个负调控。在高粱中，一项比较转录组研究使用Illumina RNA-seq对七个不同基因型的根组织进行了分析，显示对低氮处理的差异响应。分析发现，在敏感品种中，氮处理后多种胁迫响应基因（包括氧化胁迫相关基因）的转录本积累较高。相反，在耐受品种中，缺