《Current Plant Biology》：Integrating Multi-Omics and Genome Editing for Biotic Stress Resistance and Quality Improvement in Groundnut
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花生（Arachis hypogaea L.）是一种全球重要的豆科油料作物，年产量约5800万吨，其种子富含蛋白质（约30%）、油脂（约50%）及必需微量元素，为亚洲和非洲的粮食与营养安全做出重要贡献。然而，其生产力日益受到生物和非生物胁迫以及黄曲霉毒素污染等
花生（Arachis hypogaea L.）是一种全球重要的豆科油料作物，年产量约5800万吨，其种子富含蛋白质（约30%）、油脂（约50%）及必需微量元素，为亚洲和非洲的粮食与营养安全做出重要贡献。然而，其生产力日益受到生物和非生物胁迫以及黄曲霉毒素污染等食品安全问题的制约。传统育种主要聚焦于花生改良，但难以应对复杂的多性状胁迫响应。异源四倍体（AABB）基因组因基因冗余和连锁复杂性使性状定位复杂化，而强烈的基因型×环境互作也阻碍了稳定选择。近年来，新一代组学技术实现了对胁迫响应基因、通路和调控网络的系统级解析；结合基因组编辑技术，可对靶基因和调控元件进行精准操作，从而加速抗病性、胁迫耐受性和种子品质的改良。然而，现有关于花生生物技术的综述仍存在局限：多数研究将基因组、转录组、蛋白质组和代谢组学进展作为平行但独立的领域进行概述，而非考察同一研究中两个及以上组学层面的真正整合；许多研究也模糊了在花生中已实际验证的结果与仅在其他作物中证实或通过类比提出的内容，导致候选靶标与已确认编辑以相近的置信度呈现；此外，关于决定可行性的技术参数（编辑平台、递送方法、效率、纯合性、遗传、脱靶评估和田间验证）的报告往往不完整或缺失。本综述基于PRISMA 2020框架，系统检索了Scopus、Web of Science、PubMed和Google Scholar数据库（2000年1月至2026年6月），经去重和筛选后保留155项研究进行定性综合。综述首先对证据进行分级，明确区分在花生中已证实、仅在其他作物中显示以及仍处于提出阶段的内容；其次，定义整合多组学，并通过表格识别真正结合两个及以上组学层面的花生研究；第三，将生物胁迫抗性与种子品质共同涵盖，包括二者共享的工具和挑战；第四，详细呈现基因组编辑与整合研究，报告编辑平台、递送方法、效率、遗传、脱靶检测和田间测试等特征。综述旨在不仅展示这些技术在花生中的潜在应用，也阐明各项技术实际取得的进展程度，为加速培育抗病、优质的花生品种提供转化路径。
3. 花生的生物胁迫
花生生产受到真菌、细菌、病毒病原体及昆虫害虫等多种生物胁迫的严重制约。其中，由Passalora arachidicola引起的早叶斑病（ELS）和由Nothopassalora personata引起的晚叶斑病（LLS）是分布最广、经济损失最大的叶部病害，在适宜条件下可造成高达70%的产量损失。由Puccinia arachidis引起的锈病在印度等温暖热带地区可致50%的产量损失。土传真菌病害中，由Sclerotium rolfsii引起的茎腐病最具破坏性，产量损失可达80%；而Aspergillus flavus主要通过黄曲霉毒素污染影响种子品质。此外，番茄斑萎病毒（TSWV）、花生条纹病毒（PStV）及由Ralstonia solanacearum引起的青枯病等病毒和细菌病害进一步加剧了生物胁迫。昆虫害虫方面，已报道超过350种昆虫影响花生，其中Helicoverpa armigera、Aproaerema modicella和Spodoptera litura等鳞翅目害虫最具破坏性，S. litura可造成35-55%的产量损失。根结线虫（Meloidogyne arenaria）也是中国、印度和美国等主产区的重大制约因素。这些生物胁迫在田间常同时发生，但往往汇聚于共同的宿主防御通路，凸显了整合多组学与基因组编辑策略的必要性。
4. 花生改良的基因组资源
花生为异源四倍体物种（AABB基因组，约2.7 Gb），源自二倍体祖先种Arachis duranensis（A基因组）和Arachis ipaensis（B基因组）的杂交。参考基因组序列的发布为功能基因组学和分子育种提供了基础平台。高密度遗传图谱和全基因组标记系统（SSR、SNP、InDel）促进了叶斑病、锈病、青枯病等主要病害抗性及干旱耐受性和油品质相关数量性状位点（QTL）定位和全基因组关联分析（GWAS）。然而，花生对昆虫害虫抗性的遗传基础仍解析不足，抗性主要与间接防御性状相关，如叶片表面特征、毛状体密度、酚类和黄酮类代谢及蛋白酶抑制剂活性，而非单一主效抗性基因。泛基因组分析已成为捕获栽培和野生Arachis物种间结构变异和等位基因多样性的有力工具，揭示了与胁迫适应和抗病性相关的存在缺失变异（PAVs）、拷贝数变异（CNVs）和结构重排。转录组资源（RNA-seq数据集）已用于鉴定差异表达基因（DEGs）、转录因子和胁迫响应调控通路。基因组资源与表型和环境数据的整合也促进了基因组选择（GS）模型的发展，用于预测复杂性状的育种值，加速育种周期。
5. 花生多性状改良的组学方法
5.1. 基因组学方法：基因组研究在花生生物胁迫耐受性相关QTL和抗性基因的发现中发挥了重要作用。叶斑病方面，在A02和A03染色体上鉴定出主要且稳定的QTL（如qLLS-A02簇和qLLSA03.1），包含编码NBS-LRR蛋白的潜在候选基因，精细定位鉴定出LLSR1和LLSR2两个候选基因。锈病抗性方面，主要位点定位在A03和B02染色体（qRust-A03.1和qRust-B02.1），表型变异解释率可达约80%。黄曲霉毒素抗性方面，qAFTRA07.1（AhAFTr1）被鉴定为主要位点，精细定位至约103 kb区间，其中AhAftr1编码一个LRR结构域存在结构变异的NB-LRR蛋白。茎腐病GWAS可解释约58%的表型变异，青枯病抗性位点（如qBWB02.1）的候选基因包括AhGLK1b、AhRLK1和AhRRS5。A02和A09染色体上富含NBS-LRR基因的区域与根结线虫抗性相关，已从野生近缘种渐渗抗性并育成COAN和NemaTAM等抗性品种。昆虫抗性方面，花生对叶部害虫的抗性主要与酚类、黄酮类、萜类及木质素相关化合物的组成型和虫害诱导型积累有关，这些次生代谢物通过抗生作用降低幼虫存活、生长和取食效率。
5.2. 转录组学方法：转录组分析揭示了胁迫响应的基因表达动态和调控网络。叶斑病抗性研究中，RNA-seq鉴定出2,219个DEGs，包括病程相关（PR）蛋白和WRKY转录因子。锈病抗性中，抗性基因型中PR蛋白、乙烯响应因子和NBS-LRR基因上调，而感病基因型中WRKY、MYB和bZIP等关键转录因子下调。茎腐病研究中鉴定出与茉莉酸信号、受体样激酶及WRKY和锌指蛋白等转录因子相关的基因。A. flavus抗性分析鉴定了大量DEGs及参与类黄酮生物合成和免疫应答的miRNA-mRNA互作，甘氨酸富集RNA结合蛋白在感病基因型中持续上调，提示其可作为精准育种和基因组编辑的潜在靶标。病毒和细菌病害方面，TSWV抗性位点包含几丁质酶和NBS-LRR蛋白编码基因，青枯病转录组研究揭示了乙烯和茉莉酸信号通路相关基因及WRKY转录因子的差异表达。昆虫取食诱导以茉莉酸（JA）介导的信号通路为主的快速转录重编程，涉及JA生物合成、MYC和WRKY调控网络及蛋白酶抑制剂等下游防御效应因子。
5.3. 蛋白质组学方法：蛋白质组分析提供了胁迫期间蛋白质水平响应的关键见解。叶斑病和锈病抗性中，整合转录组和蛋白质组研究鉴定了参与超敏反应、信号转导和细胞壁加固的蛋白质。A. flavus抗性中，差异蛋白质组学鉴定了与免疫信号、PAMP感知、植保素生物合成和解毒相关的蛋白质。比较蛋白质组学揭示花生对Aspergillus的抗性与次生代谢、脂质代谢和胁迫响应相关蛋白的激活有关。宿主诱导基因沉默（HIGS）靶向真菌关键生物合成基因已成功减少病原侵染和黄曲霉毒素水平。蛋白质组分析表明，有效的昆虫抗性依赖于功能性防御蛋白的积累，这些蛋白并非总能从转录本丰度预测，包括蛋白酶抑制剂、过氧化物酶、氧化还原酶和胁迫响应蛋白，突出了蛋白质组学在鉴定具有生化活性的防御组分方面的重要性。
5.4. 代谢组学方法：代谢组学研究揭示了与胁迫抗性相关的关键生化通路。叶斑病抗性中，抗性基因型表现出更高的酚类化合物、黄酮类、二苯乙烯类和萜类积累。茎腐病抗性中，水杨酸、木质素和苯丙烷通路中间产物有助于系统获得性抗性。A. flavus抗性中，哌啶酸被鉴定为关键信号分子，木质素和羟基肉桂酸酰胺的积累可加固细胞壁并限制真菌入侵。代谢组研究表明，花生对潜叶蛾等昆虫害虫的抗性与酚类、黄酮类、萜类和木质素相关化合物的增强积累密切相关，这些次生代谢物通过抗生作用降低幼虫存活和取食效率，而木质化增强则限制幼虫移动和营养获取。这些组学研究共同表明，花生的生物胁迫抗性由跨越多分子层的层级调控级联控制，从基因组区域经转录激活、蛋白质积累到代谢重编程，形成从基因型到表型的协调流动。
5.5. 整合多组学与AI驱动的预测育种：整合多组学指在同一研究中生成两个及以上组学层面（基因组、转录组、蛋白质组或代谢组），并通过定义的计算方法将其结合。在花生中，这种整合目前主要依赖加权基因共表达网络分析（WGCNA）、模块-性状关联及通路或富集映射（KEGG和MapMan）。严格定义下，花生中真正的多组学整合仍有限，多数整合研究仅结合两个层面，通常为转录组和代谢组；转录组-蛋白质组-代谢组三层整合尚未实现。机器学习（ML）在花生中的应用仍有限：随机森林模型已用于基于序列、结构和表达特征对胁迫相关候选基因排序；随机森林和极端梯度提升（XGBoost）模型已用于基于无人机冠层性状估算荚果产量（随机森林R2=0.93，XGBoost R2=0.88）；深度学习方法已应用于高通量单种子表型分析。其他作物中的证据（如多组学数据改善基因预测、XGBoost模型约72%的抗病预测准确率）应视为提示性而非在花生中已证实。未来花生研究需报告算法、训练和测试样本量、数据类型、验证方法和性能指标，并在独立群体或环境中测试预测能力。
6. 花生改良的新一代精准工具
6.1. 从传统育种到精准胁迫生物学：多组学数据和AI辅助候选基因优先排序改善了胁迫响应基因的鉴定，但将其转化为改良表型仍受限于功能验证和靶向基因操作工具的缺乏。尽管QTL定位、GWAS和多组学整合取得进展，但仅有少数候选基因（如AhELSR1和AhAftr1）在功能水平得到验证。跨研究和胁迫条件下，NBS-LRR抗性基因、WRKY和MYB等转录因子、苯丙烷通路酶以及JA和SA信号调节因子等保守基因类别反复出现，是精准育种的高置信度靶标。
6.2. 基因组编辑平台：原理与花生中的递送：CRISPR/Cas系统因简单、高效且可多重编辑而成为主导平台。CRISPR/Cas9通过sgRNA引导靶向，经非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行修复。碱基编辑和引物编辑可在不产生双链断裂的情况下实现精准核苷酸改变。农杆菌介导转化是最广泛使用的方法，基于子叶节和去胚子叶的方案可获得有效的再生效率。花粉管介导转化和PEG介导原生质体系统等新兴策略为编辑构建体的快速验证提供了平台，微弹轰击胚性愈伤组织也已成功应用。
6.3. 在花生中成功验证的基因组编辑：已确认的花生基因组编辑仍限于少数靶标，主要涉及控制油酸含量的脂肪酸脱饱和酶（FAD2）基因。常规CRISPR/Cas9核酸酶编辑首次在花生中产生同源ahFAD2A和ahFAD2B基因的小插入和替换；后续研究敲除AhFAD2B后，T1代种子油酸含量超过80%；通过编辑两个AhFAD2同源基因生成了无转基因高油酸品系。碱基编辑也已实现，通过切口酶Cas9融合胞嘧啶脱氨酶在FAD2中引入靶向核苷酸替换。启动子和顺式调控元件编辑通过编辑两个同源FAD2基因的顺式调控基序，降低其种子特异性表达而保留其他组织中的功能。引物编辑已在花生中实现，通过微弹轰击将PE2构建体递送至豫花9326品种胚性愈伤组织，在乙酰乳酸合酶基因AhALS2中引入W574L突变，初始编辑效率较低（0.10%），但编辑株系可恢复再生，突变稳定遗传至T2代，产生AhALS2-A和AhALS2-B双突变体，对五种ALS抑制类除草剂具有广谱抗性，且未检测到脱靶编辑；使用内源花生EF1α-1启动子驱动切口酶-逆转录酶融合体并优化pegRNA设计后，效率提高2.9倍（至0.29%）。此外，通过农杆菌介导CRISPR/Cas9编辑八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因，获得白化花生植株，indel频率约39%，证实了稳定靶向编辑的可行性。需强调，PDS编辑仅证明可行性而非性状改良，花生中已确认的性状水平编辑涉及油品质和除草剂抗性，而非生物胁迫抗性。
6.4. 在花生中验证的转基因和基因沉默方法：过表达几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和防御素等抗真菌基因已改善对Passalora arachidicola和Nothopassalora personata等叶部病原体的抗性。RNA干扰和转基因方法已赋予对番茄斑萎病毒和花生芽坏死病毒的抗性。宿主诱导基因沉默靶向黄曲霉毒素生物合成基因aflM和aflP已减少A. flavus侵染和毒素积累。这些成就依赖于转基因表达或RNA沉默，而非靶向编辑。
6.5. 从功能研究推断但尚未在花生中编辑的靶标：AhAftr1是一个NBS-LRR基因，定位于A07染色体黄曲霉毒素抗性主效位点，其抗性由该基因赋予，抗性品种中花6号等位基因携带54 bp缺失和数个改变LRR区域的点突变。由于当时花生转化尚不可行，该等位基因在玉米中测试，与感病等位基因相比黄曲霉毒素含量降低57.3%。由于抗性依赖于特定有利等位基因而非基因功能丧失，编辑该靶标需进行等位基因替换或碱基编辑以开发抗性版本。
6.6. 基于其他作物类比提出的靶标：基于其他物种结果，MLO（白粉病）、DMR6和eIF4E（马铃薯Y病毒抗性）等感病基因被提议作为花生编辑靶标，但尚未在花生中编辑，应视为前瞻性方向。编辑感病基因并不自动赋予广谱或持久抗性，结果取决于病原体对宿主因子的依赖性、同源基因和基因家族成员间的功能冗余、所选编辑类型及基因功能丧失对植物的代价。在异源四倍体花生基因组中，冗余是特别需要考虑的因素，可能需同时编辑多个同源拷贝才能产生效果。
6.7. 油品质和生物胁迫抗性的精准工程：编辑AhFAD2A和AhFAD2B已持续产生高油酸品系，改善氧化稳定性和营养品质；AhKCS和AhFatB基因家族等额外靶标可进一步优化脂肪酸组成。需明确区分：油品质和除草剂抗性性状已通过编辑在花生中实现，而生物胁迫抗性改良目前依赖转基因或沉默方法，抗病编辑仍处于提出阶段。
6.8. 展望：迈向转化抗病性和改良种子品质：多组学与基因组编辑及AI驱动分析的整合正在重塑花生胁迫生物学。然而，转化仍受限于异源四倍体基因组（需多重编辑同源基因）、低转化效率及基因编辑作物相关监管挑战。引物编辑研究既展示了前景也体现了局限，实现了稳定可遗传编辑但效率低且仍需转基因去除步骤。未来工作应聚焦于结合多组学、AI建模和高通量表型分析，解析动态田间胁迫条件下的基因型-表型关系，并通过纳入野生Arachis种质扩大遗传多样性。
7. 花生改良中组学和基因组编辑的挑战与局限
栽培花生狭窄的遗传基础限制了生物胁迫韧性改良的等位基因多样性。异源四倍体基因组因基因冗余和同源互作使性状解析复杂化。整合多层数据集并在动态田间条件下建立直接基因型-表型关系仍具挑战性。缺乏高通量表型平台和候选基因功能验证不足制约了组学见解向育种成果的转化。机器学习可辅助整合，但受限于高质量数据不足、模型可解释性低及跨环境和跨作物可转移性差。许多通过组学鉴定的重要候选基因尚未在田间条件下进行功能验证或用CRISPR/Cas等基因组编辑工具测试。CRISPR/Cas编辑在花生中因转化效率低、再生能力随遗传背景变异及多基因修饰需求而难以部署。脱靶效应、递送机制不足和监管框架不完善进一步限制了应用。全球范围内，基因组编辑作物的监管状态差异显著，一些国家对不含外源DNA的产品采取宽松政策，而其他国家继续将其与转基因生物类似监管，给国际协调和商业化带来挑战。
8. 未来展望
未来花生研究应优先整合时间序列多组学数据集、基因组编辑验证和AI驱动预测建模，以建立动态环境条件下的基因型-表型关系。碱基编辑和引物编辑等新兴技术通过实现无双链断裂的靶向核苷酸修饰而提供更高精度。在多倍体花生中，开发高效多重编辑策略对同时靶向同源基因至关重要。转化和递送系统的平行改进（包括植物体内方法、原生质体平台和新型递送技术）有望提高编辑效率并拓宽基因型适用性。纳入野生Arachis近缘种和多样化种质将进一步促进胁迫耐受性新等位基因的发现和应用。混合AI建模框架可提高预测准确性和可解释性。最终，花生改良的未来进展将取决于多组学、基因组编辑和数据驱动预测框架在统一育种流水线中的有效整合。
9. 结论
花生的生物胁迫抗性和种子品质受多层调控网络控制，需要超越传统育种的整合方法。多组学技术已实现胁迫响应关键基因和通路的鉴定，基因组编辑为其功能验证和应用提供了精准工具。这些方法与AI驱动预测建模的整合为加速性状发现和育种提供了有力框架。然而，多倍体基因组复杂性、低转化效率和监管限制仍是重大障碍。多组学、基因组编辑和数据驱动育种的融合代表了开发抗病、优质花生品种的变革性路径。
