《Microbiology Spectrum》：Isothermal cross-priming amplification for field-deployable norovirus surveillance: a cost-effective and rapid solution
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诺如病毒仍然是全球食源性胃肠炎的主要原因。虽然等温扩增技术在速度和便携性方面较传统逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）具有优势，但中国缺乏自主研发的诺如病毒等温扩增系统。研究人员利用
诺如病毒仍然是全球食源性胃肠炎的主要原因。虽然等温扩增技术在速度和便携性方面较传统逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）具有优势，但中国缺乏自主研发的诺如病毒等温扩增系统。研究人员利用国内专利的交叉引物扩增（cross-priming amplification, CPA）技术，建立了针对主要诺如病毒基因型GII.3、GII.4和GII.17的CPA系统。使用224份经测序确认基因型的粪便样本对这些系统进行了评估。研究人员开发的CPA（Lab-CPA）系统显示出高灵敏度，可检测到98.0%（49/50）的GII.3、100%（80/80）的GII.4和96.9%（31/32）的GII.17样本，所有基因型的特异性均为100%。与经认证的临床RT-qPCR试剂盒相比，GII.3、GII.4和GII.17的总符合率分别为98.7%、99.3%和96.9%，且阈值时间呈显著线性相关。至关重要的是，Lab-CPA系统将处理时间缩短了44-60分钟（与RT-qPCR相比）。成功集成到使用一体化卡盒的商业EasyNAT平台进一步简化了工作流程，同时保持了准确性。研究人员的CPA系统提供了一种快速、经济高效且简化的诊断解决方案，非常适合资源有限的基础医疗环境中的即时检测（point-of-care testing, POCT）。
重要性：诺如病毒仍然是一个严重的公共卫生威胁，推动了对快速、可部署诊断方法的需求。虽然等温扩增在理论上比逆转录定量PCR具有优势，但中国缺乏自主研发系统导致对进口检测的依赖，限制了即时检测能力。本研究通过建立针对中国主要诺如病毒基因型的新型交叉引物扩增系统填补了这一空白。实现高灵敏度/特异性并显著缩短处理时间，这项工作验证了一种稳健、适用现场的传统方法替代方案。此外，与商业EasyNAT平台的成功整合展示了直接的转化潜力。通过提供经济高效、高性能的本土解决方案，这些发现显著增强了资源有限环境中诺如病毒感染的分散监测和应急响应能力。
诺如病毒是一种属于杯状病毒科（Caliciviridae）的高度传染性无包膜RNA病毒，是全球食源性胃肠炎的主要病原体之一。仅需10-100个病毒颗粒即可导致感染，每年约造成7亿例病例和22万例死亡，其中5岁以下儿童受影响最大。目前临床诊断主要依赖逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR），但该方法需要核酸提取、逆转录和实时PCR循环等多个步骤，全程约2-3小时，缺乏便携性。等温扩增技术如环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）和重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）虽理论上具有速度和便携性优势，但受外国专利保护，成本较高且部署受限。此外，中国流行的诺如病毒基因型以GII.3、GII.4和GII.17为主，且GII.17逐渐成为优势基因型，不同基因型临床特征存在差异，因此需要快速、经济且可区分基因型的本土化检测方案。
针对上述问题，研究人员基于国内专利的交叉引物扩增（cross-priming amplification, CPA）技术，建立了分别针对GII.3、GII.4和GII.17的三种CPA检测系统（Lab-CPA），并在224份粪便样本（162份阳性，62份阴性）中验证其性能。结果显示Lab-CPA具有高灵敏度和特异性，与RT-qPCR总符合率在96.9%-99.3%之间，阈值时间显著线性相关，且处理时间缩短44-60分钟。进一步将Lab-CPA集成到商业化EasyNAT平台，实现了全自动一体化检测，保持了良好的准确性。该研究为资源有限的基层医疗机构提供了一种快速、经济、可现场部署的诺如病毒监测方案，相关成果发表在《Microbiology Spectrum》。
关键技术方法方面，研究样本来源于2019年1月至2024年1月在复旦大学附属儿童医院临床检验中心收集的疑似诺如病毒感染者的粪便标本。研究人员首先采用临床验证的RT-qPCR对样本进行检测，通过磁珠法提取核酸，利用VP1衣壳蛋白特异性引物扩增并测序确定基因型，构建系统发育树。随后基于VP1基因保守区域设计CPA引物，在ABI 7500仪器上58°C恒温扩增并实时监测荧光信号，建立Lab-CPA。最后将Lab-CPA转移至EasyNAT平台，使用一体化卡盒自动完成核酸提取与扩增。统计学分析采用Cohen's kappa一致性检验和线性回归。
**Lab-CPA系统能够充分检测GII.3、GII.4和GII.17**
研究人员利用现有的实验室基础设施，针对流行基因型建立了三个独立的CPA系统。验证队列包含224份粪便样本，其中诺如病毒阳性162份（GII.3阳性50份，GII.4阳性80份，GII.17阳性32份）和阴性62份。系统发育分析确认所选毒株分属三个靶向基因型。结果显示，GII.3 Lab-CPA系统灵敏度为98.0%（49/50），特异性为100.0%（52/52）；GII.4 Lab-CPA系统灵敏度、特异性均为100.0%；GII.17 Lab-CPA系统灵敏度为96.9%（31/32），特异性为100.0%（48/48）。表明三个Lab-CPA系统对相应基因型的检测具有稳健且可靠的性能。
**Lab-CPA系统与RT-qPCR相比具有相当的准确性但更省时**
与临床RT-qPCR试剂盒比较，GII.3系统阳性符合率（positive percent agreement, PPA）为98%（49/50），阴性符合率（negative percent agreement, NPA）为100%（28/28），总符合率（total percent agreement, TPA）为98.7%（77/78）；GII.4系统PPA为100%（79/79），NPA为98.4%（62/63），TPA为99.3%（141/142）；GII.17系统PPA为96.8%（30/31），NPA为97.0%（32/33），TPA为96.9%（62/64）。Cohen's kappa系数分别为0.972、0.986和0.937，表明与RT-qPCR有高度一致性。将RT-qPCR的循环阈值（Ct）转换为等效反应时间Tq后，三种基因型的Lab-CPA阈值时间Tt与Tq均呈显著正线性相关。同时，Lab-CPA比RT-qPCR缩短处理时间中位数分别为53分钟、60分钟和44分钟。这说明Lab-CPA在保证准确性的同时显著提高了操作效率。
**Lab-CPA系统成功与EasyNAT平台集成**
为便于现场部署，研究人员将Lab-CPA流程整合进EasyNAT平台，该平台采用一体化卡盒在封闭系统中完成磁珠法核酸提取和CPA扩增。使用84份粪便样本（24份GII.3阳性，23份GII.4阳性，19份GII.17阳性，18份阴性）与RT-qPCR对照，EasyNAT系统对三种基因型的PPA分别为91.7%、95.7%和84.2%，NPA均为100%，TPA分别为95.2%、97.6%和91.9%，kappa系数分别为0.904、0.951和0.838。将EasyNAT的总运行时间TE与RT-qPCR等效总时间Tq′进行相关性分析，发现两者呈强正线性相关（r=0.532, P<0.0001）。这表明Lab-CPA已成功转化为全自动平台应用，具备快速、全自动检测潜力。
**讨论与结论**
讨论部分指出，CPA相比LAMP和RPA具有优势：CPA与RT-qPCR定量线性关系良好，反应温度（约60°C）高于RPA（约40°C），可减少非特异性扩增并增强对粪便中腐殖酸、胆汁盐等抑制剂的耐受性。EasyNAT系统的性能略低于Lab-CPA，可能归因于一体化卡盒提取的核酸纯度较低，且验证样本量较小。GII.17系统表现相对较弱，可能与引物结合亲和力、样本量小有关。研究局限性包括：仅覆盖三种主要基因型，尚未实现全基因型覆盖；样本保存时间差异可能影响RNA完整性；八样本通量对大规模实验室而言较低。然而，系统便携性和快速周转可在一定程度上平衡通量限制。
研究结论为：这项研究确立了CPA技术作为诺如病毒诊断的变革性解决方案。通过与RT-qPCR实现高度一致并显著缩短处理时间，研究人员的CPA系统证明了其在医院检测和资源有限环境中的适用性。这种双重能力扩大了分子诊断的范围，能够在传统实验室之外对新兴和再现病原体进行快速现场鉴定。
