污水管网输送中病毒RNA载量的追踪：来自真实世界现场实验的洞见

《Environment International》：Tracking viral RNA loads during in-sewer transport: insights from real-world field experiments

　　

呼吸道病原体的病毒RNA呈现日内变化，早晨时段载量较高。在沿污水管道相距5 km（1 h停留时间）的两个采样位置，病毒浓度显示出显著差异，其中SARS-CoV-2和乙型流感病毒（Influenza B）在下游位置出现降低。污水管道生物膜是病毒RNA的次要储库。估算疾病患病率的机制模型应考虑污水输送过程中液相主体（bulk liquid）内的RNA损失。

废水监测（Wastewater-based surveillance, WBS）通过检测常见呼吸道病毒病原体，如严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）、甲型流感病毒（Influenza A Virus, IAV）、乙型流感病毒（Influenza B Virus, IBV）和呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus, RSV）的核酸，为人群疾病动态提供重要信息。虽然废水病毒载量与临床指标相关，但尚无法直接由载量推断发病率，主要不确定性来自五个环节：排毒动态、管网内归宿与输送、采样点与策略、样品处理、分子检测。其中，管网内输送是全尺寸污水系统中了解最少的环节。为此，研究人员在瑞士苏黎世Glattstollen主干污水管开展了真实世界现场实验。该管道由两条平行管组成，干天交替运行，全长约5.3 km，直径1.1 m，干天水力停留时间约1 h，服务约12.9万人口；其所属子集水区包含149,356 m污水管道，干天湿润面积约50,030 m²。该研究论文发表于《Environment International》。

研究人员于2024年11月和2025年1月开展两轮废水采样，在管道起点（L0）和5 km处（L5）使用冷藏自动采样器采集24个小时比例混合样，L5采样延迟约1 h以匹配停留时间。生物膜于2024年1月在L0、L2.5和L5三处采集，每处设三个生物学重复。核酸提取采用Promega Wizard Enviro Total Nucleic Acid Kit并结合Zymo One-Step PCR Inhibitor Removal Kit；以小鼠肝炎病毒（Murine Hepatitis Virus, MHV）作为RNA回收内标，液相平均回收率为33%±4%，生物膜平均回收率为8%±1%。研究采用六重数字PCR（digital PCR, dPCR）同时定量SARS-CoV-2 N1/N2、MHV基质蛋白基因、IAV/IBV基质蛋白基因及RSV核蛋白基因，并以SARS-CoV-2 N1靶点进行定量；同时评估PCR抑制，阈值为40%。统计分析使用置换检验检验日内高峰的显著性，并使用贝叶斯广义线性模型（generalized linear model, GLM）估计L0至L5之间病毒RNA浓度的中位数百分比变化及95%可信区间（credible interval, CrI）。此外，对生物膜核酸提取物进行SARS-CoV-2全基因组测序，并与苏黎世污水处理厂（wastewater treatment plant, WWTP）进水样本的突变谱进行比较。

日内病毒RNA载量模式：2024年11月实验期间SARS-CoV-2在24个时样本中均可定量，RSV仅2个可定量，IAV和IBV大多低于定量限（limit of quantification, LoQ）；2025年1月所有目标病毒均被检出。将采样时间归一至00:00–23:00后，四种病毒RNA载量均在07:00–11:00出现明显高峰。该4小时时段占全天的1/6，但SARS-CoV-2载量占全天总载量的42%（2024年11月）和38%（2025年1月）；IAV、IBV和RSV在2025年1月分别占30%、19%和30%。置换检验显示，SARS-CoV-2在两轮实验中以及RSV在2025年1月实验中的早晨高峰均显著高于随机预期，且各病毒间的早晨高峰未见显著差异。这一日内变化可能反映凌晨至上午的日常如厕等活动规律，也提示污水从家庭排入管道后传输较快。

管网输送对病毒RNA浓度的影响：在L0和L5两个位置，2025年1月数据显示液相主体（bulk liquid）中SARS-CoV-2浓度中位数降低43%（CrI: ?58%至?22%），IAV降低72%（CrI: ?96%至64%），IBV降低44%（CrI: ?60%至?22%），RSV降低15%（CrI: ?36%至20%），其中SARS-CoV-2和IBV的降低具有统计学意义。2024年11月SARS-CoV-2浓度降低37%（CrI: ?68%至42%），但因L0处变异较大而未显著。两轮实验中，总悬浮固体（total suspended solids, TSS）从L0到L5均下降约60%，分别由328 mg/L降至130 mg/L和由392 mg/L降至158 mg/L。L0与L5之间的PCR抑制无显著差异，因此观察到的信号衰减不能归因于抑制差异。

污水生物膜对病毒RNA浓度的影响：9个生物膜样品中，SARS-CoV-2和IAV全部检出，RSV在7个样品中检出，IBV在2个样品中检出。SARS-CoV-2 RNA中位数浓度从L0的6,132 gc/g降至L5的3,660 gc/g，降低46%；IAV从2,088 gc/g降至984 gc/g，降低49%。MHV回收率在不同采样位置间无显著差异。结合子集水区湿润面积和生物膜单位面积质量进行估算，生物膜结合的SARS-CoV-2 RNA约占整个子集水区总病毒RNA的2.2%（范围0.8%–2.8%），表明生物膜是病毒RNA的次要储库。

生物膜样本的SARS-CoV-2全基因组测序：多数生物膜样本未能获得足够的基因组覆盖度，仅两个样本（L0_3和L5_1）可用于下游分析。其突变谱与采样日期前后苏黎世WWTP进水样本的突变谱相关性最高，相关系数分别为r=0.96和r=0.90，未发现生物膜中存在明显不同的SARS-CoV-2病毒群体。

讨论与结论：研究人员指出，早晨病毒RNA高峰可能反映早晨如厕等日常行为；若监测目标是长期纵向一致性，24小时混合采样更为合适，而若目标是疫情早期发现，则在早晨病毒浓度最高的时段进行混合采样可能提高灵敏度。管网输送中观察到的SARS-CoV-2和IBV RNA衰减不能仅由RNA降解解释，因为pH和温度在1 h内相对稳定；悬浮固体沉降可能是重要机制，TSS下降方向与RNA降低一致。生物膜虽然可吸附病毒RNA，但其所占比例较小。该研究首次在全尺寸污水管道中同时研究日内RNA动态、管网内衰减和生物膜储库，强调建立机制性发病率估算模型时必须考虑管网输送过程中液相主体内的RNA损失。未来研究应增加污水管道多点采样、测定更多理化参数，并在不同污水系统中重复实验，以推动WBS从经验相关关系走向可迁移的机制模型。