噻虫胺与吡蚜酮对大型溞的联合毒性及分子机制：一项实验与计算毒理学研究

《Environmental Pollution》：Joint Toxicity and Molecular Mechanisms of Dinotefuran and Pymetrozine to Daphnia magna: An Experimental and Computational Toxicology Study

　　

摘要：联合用药在农业生产中无处不在，然而此类混合物的联合毒性效应及相关分子机制仍知之甚少。本研究评估了啶虫脒（DNT）和吡蚜酮（PMZ）在单一化合物及二元混合物暴露条件下对大型溞的急性和慢性毒性，通过MIXTOX模型结合独立作用（IA）模型量化混合物相互作用模式，并利用计算毒理学方法阐明其潜在的分子机制。结果表明，PMZ的急性毒性是DNT的274倍，混合物毒性呈严格加性，与IA预测一致。PMZ与DNT的慢性共同暴露导致严重的加性生殖毒性：总后代数从497±20（对照组）降至27±11，首批后代延迟至第11天，后代数减少至3-5。乙酰胆碱酯酶（AChE）被认为是潜在的共同靶标，DNT-AChE结合自由能为-14.62±1.74 kcal/mol，PMZ-AChE为-18.34±2.82 kcal/mol；DFT计算揭示了电子结构差异，解释了二者结合能力的差异。本研究弥补了DNT与PMZ混合物联合毒性理解的严重数据空白，为水生环境中农药共同暴露的生态风险评估提供了可靠的实验与理论支持。

引言：在现代农业生产实践中，采用具有互补作用机制的杀虫剂混合物已成为提高害虫控制效果、扩大靶标害虫范围以及降低害虫抗性产生与扩散风险的有效策略（Madgwick和Kanitz，2023；Sparks和Nauen，2015）。然而，此类混合物的广泛使用给非靶标水生生物及生态系统带来了显著的生态风险（Wu等，2025）。与单一农药相比，混合物可能表现出联合毒性效应，包括协同作用或拮抗作用，而这些效应并不总能从单一化合物的毒性数据中预测出来（Shahid等，2019）。因此，评估混合物毒性对于完善水生生态风险评估至关重要。

新烟碱类和吡啶偶氮化合物是两大类具有高选择性和强效杀虫活性的杀虫剂，近年来在全球范围内得到广泛应用（Ahmad等，2025；Harrewijn和Kayser，1997；Jeschke和Nauen，2008）。DNT是一种第四代新烟碱类化合物，通过选择性地与昆虫中枢神经系统内的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）结合来发挥杀虫活性，破坏突触传递，最终导致麻痹和死亡（Liu等，2021）。PMZ是一种独特的杂环杀虫剂，属于吡啶偶氮化合物家族，通过靶向刺吸式害虫的弦音器作为取食阻断剂发挥作用，从而抑制其取食行为并导致饥饿死亡（Joseph等，2011）。由于其对耐药性蚜虫和粉虱种群的高效防治效果，PMZ常被与新烟碱类杀虫剂联合使用以提高综合害虫管理的效果（Karatolos等，2010）。DNT和PMZ均溶于水，可通过农业径流、喷雾飘移和淋溶进入水生系统（Li等，2011；Zhang等，2024）。田间应用证据也支持啶虫脒与吡蚜酮在水稻害虫防治中的联合使用（Poonam等，2025）。DNT和PMZ均已在农业水生环境中被检测到。据报道，DNT在鄱阳湖流域农业水道中的浓度高达802±139 ng/L，在稻田水中施用后浓度高达720 μg/L（Xiong等，2021；Yokoyama等，2015）。PMZ也在稻田水中被检测到浓度为0.029至0.033 mg/L，在河水中浓度为ND至260.8 ng/L（Elfikrie等，2020；Zhang等，2015）。此外，在中国水稻田场景下预测的地表水浓度范围为PMZ 0.485至91.34 μg/L，DNT 0.172至25.03 μg/L（Chen等，2020）。在自然水生环境中，农药很少单独存在，通常以混合物形式出现（He等，2023；Ulrich等，2022），引发了对其对非靶标水生生物和生态系统联合效应的担忧（Cho等，2023；Kobashi等，2017）。鉴于DNT和PMZ具有不同的作用机制，共同暴露于这两种化合物可能导致复杂的毒理学相互作用，可能相较于单一化合物暴露加重对水生生物的有害影响。

水生无脊椎动物，特别是大型溞，是淡水食物网的重要组成部分，作为初级消费者将浮游植物与更高营养级联系起来（Ebert，2022；Reilly等，2023）。由于其高敏感性、短生命周期和标准化的测试方案，大型溞被广泛用作水生生态毒性测试的模式生物（OECD，2004）。先前的研究已阐明了DNT和PMZ对大型溞的单独毒性影响。例如，Bartlett等（2019）揭示了DNT显著抑制了大型溞的繁殖和生长，而Liu等（2022）记录了PMZ引发氧化应激和DNA损伤——这些效应与人类健康相关——同时强调了新烟碱类（NEOs）与其他农药之间潜在的协同或加性相互作用。尽管关于单一农药毒性的研究日益丰富，但在DNT与PMZ暴露对大型溞的联合效应方面仍存在重大知识空白。这一局限性严重削弱了这些杀虫剂在水生系统中生态风险评估的准确性。此外，二者相互作用的性质和程度仍未得到充分表征。由于DNT和PMZ具有不同的作用机制和主要分子靶标，独立作用（IA）模型适用于评估它们的联合毒性。该模型用于预测通过不同靶标发挥作用的化学物质的联合效应（Dietrich等，2022）。MIXTOX分析通过将观察到的混合物效应与基于IA的预测进行比较，进一步确定观察到的混合物效应是加性的、协同的还是拮抗的（Van Loon等，2025）。然而，这些联合效应背后的分子机制仍不清楚。

另一个重要的空白是计算毒理学工具在大型溞农药混合物研究中的有限整合。尽管分子对接、分子动力学（MD）模拟及相关计算方法已被广泛应用于单一污染物毒理学中以阐明污染物-生物分子相互作用机制（Li等，2025a；Shahbaaz等，2018），但它们在混合物毒性研究中的使用仍然稀缺（Belfield等，2023）。大多数混合物毒性研究仍主要依赖体内或体外终点，对分子水平相互作用机制的分析相对有限（Brun等，2019）。这一局限性限制了农药混合物效应的机制解释，并可能降低水生风险评估的准确性。

鉴于这些关键的知识空白，本研究的主要目标有四点：（1）系统评估DNT和PMZ的急性毒性，以48小时中位有效浓度（EC50）表示，以及它们对大型溞关键生物终点的慢性21天效应，包括存活、繁殖、生长和行为反应；（2）使用MIXTOX模型结合IA参考模型，表征DNT和PMZ联合毒性相互作用的性质与程度；（3）利用计算毒理学方法探索潜在的分子机制，包括分子对接、MD模拟和DFT计算；（4）基于现实的环境暴露浓度，对DNT、PMZ及其混合物进行全面的环境风险评估。通过实现这些目标，本研究旨在填补DNT与PMZ联合毒性数据的当前空白，为这些农药的安全可持续使用提供科学依据，并支持制定更全面且生态相关的水生环境保护政策。

化学品与试剂：DNT和PMZ（纯度≥98%）储备溶液（各1000 mg/L）使用HPLC级甲醇（≥99.9%）配制（表S1）。工作溶液在使用前通过将储备溶液用M4培养基稀释新鲜配制（OECD，2004）。所有化学品和试剂盒的来源、等级和纯度的详细信息见表S3，M4培养基的组成列于表S2。所有测试溶液中甲醇的最终浓度≤0.1%，未显示毒性。

暴露浓度验证：在急性和慢性繁殖测试期间，PMZ和DNT的实测浓度范围为名义浓度的82%至116%。详细分析结果见补充材料（表S7-S9）。由于实测浓度接近名义值，统计分析中使用了名义浓度。

个体毒性：空白对照组和溶剂对照组在急性生物测试结束时的存活率分别为100%。EC50值与结论……

结论：在本研究中，我们结合了急性和慢性毒性测试、混合物建模、分子模拟和环境风险评估来评估DNT和PMZ对大型溞的联合效应。PMZ的急性毒性远大于DNT，两种化合物在慢性暴露下均抑制繁殖和生长。混合物毒性在两个时间尺度上均严格呈加性，并被IA模型很好地预测，支持了共存的定量风险预测。对接、MD和DFT……

CRediT作者贡献声明：Chi Wu：撰写——原始草稿，方法论，调查研究，资金获取，正式分析，概念构思。Mengjin He：撰写——原始草稿，可视化，正式分析，数据整理。Lizhen Zhu：验证，监督。Xingang Liu：撰写——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取。Lang Chen：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，概念构思。Shankui Yuan：调查研究，数据整理。Lan Zhang：

未引用参考文献：Li等，2025；Lin等，2021；Wang等，2019；Zhang等，2023。

伦理声明：本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：经合组织化学品测试指南，测试第202号：溞属急性固定测试，和测试第211号：大型溞繁殖测试。不需要伦理委员会批准。根据适用的机构法规，涉及大型溞的实验不需要伦理批准。本研究按照经合组织测试指南第202号和

数据可用性：支持本研究结果的数据可从通讯作者处应合理要求获得。

利益冲突声明：作者声明没有利益冲突。

资助：本工作得到中国国家重点研发计划（编号2024YFD1701101）、国家自然科学基金（编号32472616）和农业科技创新计划（编号CAAS-BRC-GLCA-2025-01）的支持，通过项目"绿色纳米农药：减量机制、协同效率和源控污染缓解"。

利益冲突声明：? 作者声明没有已知的可能影响本文所述工作的相互竞争的财务利益或个人关系。

致谢：本工作得到中国国家重点研发计划（编号2024YFD1701101）、国家自然科学基金（编号32472616）和农业科技创新计划（编号CAAS-BRC-GLCA-2025-01）的支持，通过项目"绿色纳米农药：减量机制、协同效率和源控污染缓解"。

Chi Wu | Mengjin He | Shankui Yuan | Lan Zhang | Liangang Mao | Lizhen Zhu | Xingang Liu | Lang Chen

植物病虫害生物学国家重点实验室，中国农业科学院植物保护研究所，北京100193，中国