一种新型基于黄酮醇的荧光探针，用于检测聚苯乙烯微塑料引起的肝脏损伤中的谷胱甘肽（GSH）耗竭情况

《Environmental Pollution》：A Novel Flavonol-based Fluorescent Probe for Detecting GSH Exhaustion in Polystyrene Microplastic-Induced Liver Injury

　　摘要：聚苯乙烯微塑料（PS-MPs，<5毫米）是一种无处不在的污染物，通过饮食暴露在肝脏中积累，导致肝细胞损伤。然而，PS-MPs暴露下谷胱甘肽（GSH）的动态变化及其背后的损伤机制仍然知之甚少。在本研究中，我们利用天然黄酮醇的可调节激发态分子内质子转移（ESIPT）特性开发了一种GSH激活的黄酮醇探针BQ-N。从结构上看，BQ-N包含一个2,4-二硝基苯磺酰（DNBS）基团作为荧光淬灭基团，通过巯基介导的亲核取代反应实现选择性荧光恢复。BQ-N探针成功用于实时监测活细胞中以及由PS-MPs暴露引起的肝脏损伤的小鼠模型中的GSH。进一步的机制研究表明，PS-MPs暴露会下调谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和铁蛋白的表达，同时上调氧化应激相关蛋白血红素加氧酶-1（HO-1）和醌氧化还原酶1（NQO1）的表达。这些发现表明，PS-MPs可能通过干扰GSH代谢和氧化还原平衡来激活铁死亡途径，从而介导肝脏损伤。总之，BQ-N探针能够通过荧光成像在细胞水平和离体动物器官上实时可视化GSH，为PS-MPs引起的肝脏损伤提供了有效的早期检测工具。此外，它还从GSH-铁死亡轴的角度揭示了微塑料肝毒性的部分分子机制，为整合环境污染物健康风险评估与分子成像技术提供了新的见解。

引言
微塑料（MPs，颗粒大小<5毫米）作为新兴的环境污染物类别，引起了广泛的科学关注。其中，聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）由于它们的持久性、广泛的分布和在各种环境介质中的强生物累积潜力而成为公共卫生研究的焦点（Casella等人，2025年）。PS-MPs可以通过多种途径进入生物体，包括摄入、呼吸和皮肤吸收。一旦内化，这些颗粒会通过食物链传递在生物体内逐渐积累。胃肠道是PS-MPs暴露的主要接口。越来越多的证据表明，摄入的PS-MPs会破坏肠道屏障的完整性，增加上皮通透性，并引起肠道微生物群的失调（Cornelli等人，2026年；Prata等人，2020年）。这些颗粒随后可以通过旁细胞或跨细胞途径穿过肠黏膜进入血液循环，最终通过门静脉到达肝脏——这是肠-肝轴的关键途径（En-Nejmy等人，2024年；Wu等人，2026年）。当通过门静脉到达肝脏时，PS-MPs通过与亚细胞器的复杂物理相互作用发挥其毒性作用，导致线粒体电子传递链中断并触发活性氧（ROS）的产生增加（Gu等人，2025年；Li等人，2025年；Wei等人，2025年）。这种氧化/抗氧化平衡的破坏会引发一系列有害效应，包括肝细胞膜的脂质过氧化、氧化DNA损伤和蛋白质功能障碍，最终导致不可逆的肝组织损伤（Cornelli等人，2025年；He等人，2024年；Tao等人，2024年；Wang等人，2026年；Wu等人，2023年；Yao等人，2023年）。尽管有这些观察结果，但PS-MPs暴露与肝细胞损伤之间的精确分子机制——特别是关于谷胱甘肽（GSH）平衡的破坏及其与铁死亡的联系——仍不明确。阐明这些机制对于理解PS-MPs的全面肝毒性及其制定针对性的干预策略至关重要。

谷胱甘肽（GSH）是一种关键的内源性抗氧化三肽，含有还原性的半胱氨酸，在维持氧化还原平衡中起着基本作用。主要在肝脏中合成，GSH在肝组织中含量丰富，并具有强大的巯基还原能力（Asantewaa等人，2024年；Vázquez-Meza等人，2023年）。此外，GSH在外源性物质的首次代谢解毒中起着关键作用，并构成抗氧化防御系统的重要组成部分。在铁死亡（一种依赖铁的细胞死亡形式）中，GSH通过调节抗氧化防御系统和氧化还原平衡起着关键作用。这一过程通常伴随着脂质过氧化物的积累和细胞内GSH的耗竭（Georgiou-Siafis & Tsiftsoglou，2023年；Rochette等人，2022年；Xue等人，2025年；X. D. Zhang等人，2023年）。值得注意的是，作为核心抗氧化分子，GSH有望成为对抗PS-MPs毒性的潜在保护物质（Ma等人，2026年）。因此，实时监测肝组织中的GSH动态可以通过荧光成像来阐明PS-MPs引起的肝脏损伤的分子机制。

目前，有多种传统的GSH检测方法，如质谱（MS）（Poimenova等人，2024年）、高效液相色谱（HPLC）（Tsiasioti & Tzanavaras，2023年）、原子吸收光谱（AAS）和电化学方法（Baecker & Guenther，2022年；Cheng等人，2022年）。然而，这些方法通常存在局限性，如灵敏度低、操作复杂和仪器笨重，限制了它们在生物样本中的应用。相比之下，荧光探针技术因其高灵敏度、操作简单、高选择性和生物相容性而被广泛用于生物样本的检测（Wang等人，2025年）。因此，开发新的GSH检测方法为基于氧化应激生物标志物的早期预警系统提供了重要支持，并为针对微塑料暴露的创新诊断和治疗策略奠定了基础。近年来，由于高灵敏度和特异性，探针技术在医学和环境分析方面取得了显著进展。目前，已经开发并应用了多种针对谷胱甘肽（GSH）的荧光探针来检测生物系统和环境样本（Chen等人，2025年；Suna等人，2025年；Zhang等人，2025年）。然而，能够特异性监测由PS-MPs暴露引起的肝细胞内GSH动态变化的荧光探针仍然很少。作为黄酮类化合物的一个主要亚类，黄酮醇具有基本的3-羟基-2-苯并吡喃-4-酮骨架。它们广泛分布于各种植物物种中，在植物次生代谢中起着关键作用（Ma等人，2024年；Shen等人，2022年；Zhuang等人，2023年）。这些化合物不仅表现出常见的生物活性，如抗氧化和抗炎作用，而且由于它们出色的光物理性质而在荧光探针设计中受到显著关注（Oteiza等人，2021年）。具体来说，黄酮醇结构具有以下独特优势：首先，它们的衍生物（例如3-羟基黄酮）通常表现出明显的激发态分子内质子转移（ESIPT）特性，伴随着较大的斯托克斯位移、高荧光量子产率和良好的光稳定性（Demidov等人，2025年；Pivovarenko，2023年；Pivovarenko & Klymchenko，2024年；Sahu & Mishra，2022年；Samanta等人，2024年；Tong等人，2021年）。其次，黄酮醇骨架提供了灵活高效的合成路线，通常可以通过简单的醛-醛缩合和环化步骤实现（Ma等人，2025年；R. Wang等人，2023年；Yang等人，2026年）。此外，这些分子通常具有优异的生物相容性、低细胞毒性和易于跨膜渗透性，使其非常适合活细胞和体内成像研究（Li等人，2020年；Xu等人，2025年）。更重要的是，通过对黄酮醇核心上的羟基等官能团进行化学修饰，可以合理控制它们的光谱特性、选择性和响应机制（Hong等人，2024年；Sun等人，2025年；Tong等人，2023年；Xiao等人，2024年；Y. Zhang等人，2023年）。随着对创建用于特定生化标记的新型黄酮醇衍生探针的兴趣持续增加，本研究介绍了一种名为BQ-N的GSH响应黄酮醇荧光探针的设计和合成。该探针包含一个2,4-二硝基苯磺酰（DNBS）基团作为荧光淬灭基团，通过位点特异的羟基修饰与GSH识别位点连接。此外，它利用巯基介导的亲核取代反应来促进荧光信号的恢复。BQ-N在模拟的生理环境中表现出优异的选择性。此外，它能够动态追踪活肝细胞中的GSH水平，并在由PS-MPs暴露引起的急性肝脏损伤的小鼠模型中显示GSH显著下降（图1）。这些发现表明，BQ-N是一种创新的分子工具，为早期检测与微塑料诱导的肝毒性相关的生物标志物提供了可靠的技术支持。

实验部分
相关材料和一般实验方法的详细信息由支持信息提供。

BQ-N的设计
黄酮类化合物作为天然产物家族的重要组成部分，由于其药理活性和光物理性质成为化学生物学研究的主要关注点。其中，黄酮醇衍生物表现出优异的荧光特性，这主要归因于独特的激发态分子内质子转移（ESIPT）效应。这一过程通过分子内氢键促进，不仅导致显著的斯托克斯位移（通常>100纳米），还...

结论
总之，我们开发了BQ-N，这是一种基于苯并黄酮骨架的GSH响应开启型荧光探针。该探针具有快速响应动力学、对GSH的高选择性以及对其他生物硫醇的高选择性，能够在活细胞中实时可视化GSH动态。值得注意的是，在PS-MPs引起的肝脏损伤的小鼠模型中应用BQ-N时，我们观察到剂量依赖性的GSH耗竭，这与铁死亡途径的激活相一致。

作者贡献声明
Hang You：写作 - 审阅与编辑、调查、形式分析、数据管理。
Yuzhi Li：资源、方法学、调查、资金获取。
Qiao Wei：写作 - 审阅与编辑、形式分析、数据管理。
Jianwei Cui：写作 - 原始草稿、调查、形式分析、数据管理。
Yong Wu：写作 - 审阅与编辑、项目管理、方法学、概念化。
Yuyu Fang：写作 - 审阅与编辑、项目管理、方法学。
Gang Wang：写作。

未引用的参考文献
Wang等人，2023年；Zhang等人，2023年。

伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获得成都中医药大学实验室动物伦理委员会的批准（批准编号2025093）。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢
本研究得到了四川省自然科学基金（编号2025ZNSFSC0580，编号2026NSFSC0625）的财政支持。

Yuzhi Li | Hang You | Jianwei Cui | Qiao Wei | Yong Wu | Gang Wang | Tao Sun | Zhixing Cao | Yuyu Fang | Yong Wu
四川省中医药学校药剂学院，中华人民共和国四川省成都市611137