由Nrt蛋白介导的弱电场调控硝酸盐转运的分子机制

《Environmental Research》：Molecular Mechanisms of Weak Electric Field-Regulated Nitrate Transport Mediated by Nrt Protein

　　

摘要

NO₃^-的跨膜运输是微生物氮素吸收与转化的关键步骤，对氮循环效率具有重要影响。然而，外电场调控硝酸盐转运蛋白功能的分子机制仍不明确。本研究采用分子动力学模拟方法构建了不同跨膜电场条件下的Nrt转运体系，并利用无创微测试技术（NMT）对结果进行了实验验证。结果表明，在所构建的体系中，-10 mV/?的电场显著增强了NO₃^-的跨膜运输，使其通过NrtB通道的时间较无场条件缩短了约2.8倍。相反，在+10 mV/?的电场下，NO₃^-被困在结合位点附近，无法有效运输。机制分析揭示，负电场增强了NrtA与NO₃^-之间的相互作用，优化了界面静电环境，并提高了NrtB通道的构象适应性，从而降低了运输能垒；而正电场则产生相反效果。NMT测量进一步证实，在负电位处理下NO₃^-的内流最强，其次是开路处理和正电位处理，与模拟结果一致。本研究阐明了电场调控NO₃^-运输的分子机制，为优化弱电场下生物电化学系统中的氮素转化提供了理论依据。

引言

氮素转化过程广泛参与自然生态系统和工程水环境中的生物地球化学循环（Li, 2026; Wang et al., 2025），其效率直接影响氮的生物可利用性及相关环境影响（Han and Zhou, 2022; Ma et al., 2025）。NO₃^-作为环境中主要的无机氮形态之一，不仅作为蓝藻和藻类等光合微生物的重要氮源（Ding et al., 2022; Howarth et al., 2021），也是微生物反硝化和同化代谢的关键底物（Zhang et al., 2023a）。NO₃^-被细胞吸收后，可被胞内酶系统快速利用，而其进入细胞则依赖于专门的膜转运系统。先前的研究表明，Nrt（硝酸盐/亚硝酸盐转运体）系统作为主要的ATP结合盒（ABC）型转运蛋白，负责蓝藻及其他微生物的NO₃^-吸收，其运输效率直接决定了细胞利用外部氮源的能力（Llarena et al., 2006）。突变研究表明，NrtA的缺失会显著损害硝酸盐的摄取，即使胞内硝酸盐还原酶活性未受影响，细胞生长仍可能因底物供应不足而受到限制（Omata et al., 1989; Sakamoto and Bryant, 1999）。此外，动力学研究提示，在低硝酸盐条件下，跨膜运输可能成为胞内还原和同化之前NO₃^-利用的关键限速步骤（Agüera et al., 1990; Wang et al., 2003）。因此，阐明Nrt介导的NO₃^-跨膜运输的分子机制，对于理解微生物氮素利用和提高氮素转化过程效率具有根本性意义（Islam, 2022; The et al., 2021）。

弱电场广泛存在于自然沉积环境、生物膜界面和生物电化学系统中（Ghafari et al., 2008; Huang et al., 2024; Zhu et al., 2024）。先前的研究表明，适当强度的弱电场可以影响膜电位（Stratford et al., 2019）、膜通透性（Deng et al., 2023; Wang et al., 2023a）、胞外电子传递以及生物膜界面行为（Liu et al., 2025; Zhang et al., 2023b），从而影响生物系统内的氮素转化过程（Gill et al., 2014; Huang et al., 2022）。然而，目前关于电场增强氮素转化的研究主要关注宏观反硝化性能（Zhao et al., 2016; Zhu et al., 2024）和微生物群落响应（Koropatkin et al., 2006; Nagore et al., 2003; Yao et al., 2024），而其对膜转运蛋白功能的底层影响仍未得到充分探索。对于Nrt转运系统而言，现有研究主要集中在结构表征、底物识别机制和生理功能验证方面（Koropatkin et al., 2006; Nagore et al., 2003）。相比之下，Nrt介导的NO₃^-跨膜运输在外电场条件下的动态响应尚未得到系统研究。此外，传统的实验方法，包括荧光标记（Nakatsu and Tsukiji, 2023）、膜片钳技术（Hamill and McBride, 1997）和蛋白质晶体学（Gao et al., 2026; Nussinov et al., 2023），往往难以连续追踪蛋白质构象转变、蛋白质-底物相互作用和离子的跨膜迁移。因此，弱电场调控Nrt转运功能的分子机制仍知之甚少。分子动力学（MD）模拟为在原子尺度上动态表征蛋白质构象演化、底物结合行为和离子迁移路径提供了强有力的方法，从而为电场调控膜转运过程的机制提供了有价值的见解（Jiang et al., 2020; Lee et al., 2022; Sinha et al., 2022）。同时，原子-连续方法为将原子尺度描述与更大尺度的流体和带电粒子输运过程联系起来提供了互补的框架（Zhou et al., 2026）。

基于上述考虑，本研究结合分子动力学模拟和无创微测试技术（NMT），研究了弱电场对Nrt介导的NO₃^-跨膜运输的影响。模拟在0、-10和+10 mV/?的电场强度下进行。从三个连续阶段考察了运输过程，包括NO₃^-的捕获、转移和跨膜定位。此外，利用NMT测量的细胞NO₃^-通量对模拟预测的电场依赖性趋势进行了实验评估。本工作为电场调控膜转运蛋白功能的机制提供了分子水平的见解，并为优化生物电化学系统中的氮素转化过程提供了理论依据。

章节摘要

模拟体系的构建

NrtA和NrtBCD转运复合体的结构分别取自NrtA的已报道晶体结构（PDB ID: 2G29）（Koropatkin et al., 2006）和来自Anabaena sp. PCC 7120的NrtBCD转运体复合体结构（PDB ID: 8WM8）（Li et al., 2024）。结合态NO₃^-离子的初始坐标保留自实验结构。蛋白质结构使用PyMOL 2.5.2进行预处理，包括去除非必需分子、添加

模拟体系的构建与稳定性验证

Nrt（硝酸盐/亚硝酸盐转运体）是一种广泛分布于蓝藻及其他微生物中的ABC型硝酸盐/亚硝酸盐转运体。它由周质底物结合蛋白NrtA、跨膜结构域NrtB以及核苷酸结合结构域NrtC和NrtD组成，共同介导NO₃^-的识别、递送和跨膜运输全过程（图1）（Swapnil et al., 2021）。先前的研究已在NrtA中鉴定出Lys269、His196、Trp102和Gly240

结论

本研究结合分子动力学模拟和NMT技术，系统研究了跨膜电场对Nrt转运系统介导的NO₃^-运输的影响。结果表明，电场显著调控了NO₃^-的识别、转移和跨膜定位。与无场条件相比，负电场增强了NrtA与NO₃^-之间的相互作用，优化了局部静电环境

CRediT作者贡献声明

刘浩东：方法学。林峰：资源支持。高磊：资源支持。朱光灿：撰写—审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化设计。郭伟：撰写—初稿、可视化、方法学、调查研究、形式化分析、数据整理、概念化设计

未引用参考文献

The et al., 2021.

利益冲突声明

? 作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金委员会（批准号 42177102）的支持，并感谢中关村学苑无创微测试技术产业联盟的刘云奇以及山东农业大学农学院科研与实验中心在NO3-通量测量方面提供的技术支持。

郭伟 | 刘浩东 | 林峰 | 高磊 | 朱光灿

东南大学能源与环境学院，南京 210096，中华人民共和国