脂质纳米颗粒封装的线性DNA表达盒对小鼠甲型流感病毒提供完全保护

《mSphere》：Linear DNA expression cassette encapsulated in lipid nanoparticles confers complete protection against influenza A virus in mice

　　

基于DNA的疫苗已被开发并测试用于包括甲型流感病毒（IAV）在内的多种感染性病原体。细菌质粒DNA广泛用作递送编码疫苗免疫原基因载体，但常规质粒构建体中含有抗生素抗性基因引发安全性担忧。通过PCR产生的缺乏抗生素抗性基因及细菌序列的线性DNA表达盒可作为更安全的替代载体。本研究采用IAV小鼠模型评估PCR扩增含IAV H1N1血凝素（HA）基因的脂质纳米颗粒（LNP）封装线性DNA表达盒的保护效力，并构建含相同基因的环状质粒DNA作为对照。LNP封装线性DNA（LNP-L）与LNP封装环状质粒DNA（LNP-P）在粒径、多分散指数、ζ电位及包封率等理化性质相似，但LNP-L在细胞培养中转基因表达显著低于LNP-P。接种LNP-L的小鼠抗体应答起始晚于LNP-P组，但加强免疫后两组体液与细胞免疫应答强度相当，且均诱导Th1与Th2应答。重要的是，接种LNP-L或LNP-P的小鼠在致死剂量IAV H1N1攻毒后均完全保护。结果表明LNP封装线性DNA表达盒是疫苗开发的有前景策略。

研究背景与立项依据

DNA疫苗自20世纪90年代被发现以来，因非感染性、低成本、易放大及常温稳定等特性，成为应对新发传染病的重要平台。然而其转化受两大瓶颈制约：一是常规环状细菌质粒携带抗生素抗性基因与复制原点，存在抗性基因向受体菌群水平转移的风险；二是裸DNA细胞内吞效率低，需依赖电穿孔、基因枪或纳米递送系统增强摄取。脂质纳米颗粒（LNP）已被证实可高效包裹mRNA与DNA，保护核酸免遭降解并促进细胞摄取，且本身具佐剂属性。尽管LNP封装环状质粒DNA已在多动物模型中展现强免疫原性，但LNP能否有效封装PCR来源的线性DNA表达盒（仅含启动子、抗原基因、poly(A)信号）此前未被探索。该研究以甲型流感病毒（IAV）H1N1为模型，由研究人员直接比较LNP封装线性DNA（LNP-L）与LNP封装环状质粒（LNP-P）的理化特征、体外表达、小鼠免疫原性及致死攻毒保护效力，论文发表于《mSphere》。

主要关键技术方法

研究人员采用两轮PCR从pCI骨架扩增约2.4 kb线性盒（含CMV增强子/启动子、eGFP-Nluc或H1N1 HA基因、SV40 late poly(A)信号），经浓缩与酚氯仿纯化后，与MC3/DOTAP/DSPC/胆固醇/DMG-PEG2000按42:10:8:38:2摩尔比乙醇相混合，以微流控混合（水相乙酸缓冲液pH4.0）制备LNP，表征粒径、PDI、ζ电位及包封率。体外以HEK-293T转染评估eGFP荧光、流式阳性率、NanoLuc荧光素酶活性和Western blot。体内试验使用6周龄雌性BALB/c小鼠（Charles River，n=15/组），分LNP-P、LNP-L、非接种（NV）三组，第0、21天肌注10 μg DNA，第50天以20 MLD₅₀鼠适应H1N1 A/California/07/2009(CA09)滴鼻攻毒；血清动态测血凝抑制（HI）与全病毒ELISA亚型IgG1/IgG2a/IgG2b；脾细胞做IFN-γ ELISpot及胞内细胞因子流式（CD4/CD8与IFN-γ/TNF-α/IL-2）；攻毒后第5天取肺测TCID₅₀、H&E病理评分、RNAscope原位杂交（ISH）计NP转录阳性细胞。

研究结果

LNP封装线性DNA体外表达低于质粒DNA

LNP-L与LNP-P粒径约65 nm、PDI~0.1、ζ电位分别为?4.4 mV与?2.0 mV、包封率93.1%对91.7%，理化可比。HEK-293T转染36 h后，LNP-L的GFP阳性细胞率10.6%远低于LNP-P的47.9%，NanoLuc活性低3倍，Western条带更弱，证明线性DNA因核内核酸酶降解致表达峰值早、总量低。

LNP线性DNA诱导小鼠系统性抗体应答

LNP-P组第21天（首免后、加强前）即检出HI，第49天均数1:80；LNP-L组HI迟至第28天（加强后1周）出现，滴度低约1 log₂但无统计差异。全病毒ELISA显示LNP-P的IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b在各时间点显著高于NV；LNP-L仅第49天达显著，且第49天各亚型均值与LNP-P无差异，提示加强后体液总量可比。

LNP线性DNA诱导T细胞应答

第49天脾细胞肽池刺激，ELISpot示两免疫组对pool1/pool4的IFN-γ斑点数均显著高于NV且组间无差，累计斑点数同效。流式显示LNP-P的CD4⁺与CD8⁺中IFN-γ⁺、TNF-α⁺、双阳细胞频率高于NV；LNP-L组CD8⁺ TNF-α⁺与双阳亦显著高于NV，CD4⁺部分亚群未达显著，但整体细胞免疫幅度与LNP-P相当，且IgG1+IgG2a/b并存提示Th1/Th2混合偏移。

LNP线性DNA对致死攻毒完全保护

攻毒后NV组第2天减重、第7天全部达终点死亡；LNP-P与LNP-L组14天零减重、100%存活。第5天肺匀浆MDCK滴定，NV组10^3.75–10^4.75 TCID₅₀/100 mg，两免疫组未检出活病毒。H&E示NV广泛炎性浸润与肺泡实变，免疫组结构完整；RNAscope ISH示NV支气管上皮与实质大量NP⁺细胞，LNP-P无检出，LNP-L偶发，ISH评分免疫组均显著低于NV。

讨论与结论翻译

细菌质粒虽常用但含抗生素抗性基因存安全隐患，PCR线性盒仅含必要元件且可无细胞合成。本研究证实用LNP封装该线性盒在小鼠IAV模型中获完全保护。LNP-L与LNP-P理化相当，但体外转基因表达低，归因于线性DNA被胞内核酸酶快速降解、峰值约48 h后衰减。体内LNP-L抗体起始延迟，疑因抗原量低限制生发中心与B细胞扩增，但加强后各IgG亚型幅值追平LNP-P；细胞免疫在第49天评估时组间无差。综上，LNP可有效封装线性DNA表达盒，两次免疫即诱导与环状质粒相当的Th1/Th2与CD8⁺效应应答并完成保护；该平台免去了细菌发酵、抗性标记与内毒素污染风险，适合新发传染病快速响应，但线性DNA表达偏弱致免疫起始慢，未来需通过末端修饰（如核定位序列）提升表达与免疫原性。