《Experimental Parasitology》：Therapeutic effect of curdlan in experimental visceral leishmaniasis is mediated by activation of NLRP3 inflammasome
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Curdlan 通过 IL-1β 和一氧化氮显著地帮助清除寄生虫。
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作为 IL-1β 信号通路的关键调节因子，NLRP3 炎症小体被 curdlan 强烈激活。
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IL-1β 的生成依赖于启动（NF-κB 依赖性）和激活（活性氧物种）信号。
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Curdlan 通过 IL-1β 和一氧化氮显著地帮助清除寄生虫。
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作为 IL-1β 信号通路的关键调节因子，NLRP3 炎症小体被 curdlan 强烈激活。
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IL-1β 的生成依赖于启动（NF-κB 依赖性）和激活（活性氧物种）信号。
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Pro-IL-1β 向其生理活性形式的转化依赖于 caspase-1 的激活。
引言
内脏利什曼病是一种由昆虫传播的寄生虫病，主要由属于 Leishmania donovani 复合体的原生动物寄生虫引起，包括 L. donovani 和 L. infantum。据报道，目前有大约 1200 万人在 88 个国家感染了这种疾病，特别是在热带和亚热带地区，每年新增病例估计为 50 万例。由于人类免疫缺陷病毒 (HIV) 的共感染，这种致命的利什曼病病情更加严重 [1]。许多内脏利什曼病病例，尤其是在印度，已经对一线药物（如五价抗锑剂、米替福辛和两性霉素 B）不再敏感 [2]。这些药物不仅毒性很高，而且还伴有严重的副作用。因此，迫切需要寻找可靠的内脏利什曼病替代药物。目前，来自天然来源的免疫调节剂比传统药物更受欢迎，因为它们能够改善宿主的免疫系统。
大量的天然来源的生物分子已被研究作为潜在的抗寄生虫剂。然而，由于对这些化合物的机制理解不足，它们难以被纳入传统医疗应用中。Curdlan 是一种线性的 β (1→3)-葡聚糖，是一种生物反应调节剂 (BRM)，由非致病细菌 Alcaligenes faecalis var. myxogenes 产生 [3]。Curdlan 对健康也有益处，在韩国、台湾、日本和美国被批准作为食品使用 [4, 5]。此外，Curdlan 还被广泛用于改善加工食品的质地。据报道，Curdlan 具有多种免疫调节活性，包括抑制肿瘤生长以及抗真菌和抗疟疾作用 [6, 7]。Curdlan 的免疫调节功能已在树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤 (NK) 细胞中得到证实，这归功于膜结合的 C 型凝集素受体 dectin-1 的作用，该受体可诱导产生诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)、白细胞介素 12 (IL-12) 和肿瘤坏死因子-α (TNF-α) [6, 8]。作为主要的多种炎症细胞因子，IL-1β 在局部和全身炎症反应中起着重要作用，通过促进其他细胞因子的表达来帮助控制细胞内感染。早期研究发现，IL-1β 对辅助 T 细胞 17 (Th17) 的启动和分化至关重要 [9]。我们之前已经证明，Curdlan 通过触发 Th1/Th17 反应和 NO 上调，完全治愈了实验性内脏利什曼病 [10]。然而，在 L. donovani 感染过程中，控制 Curdlan 治疗后 IL-1β 合成和分泌的确切分子机制仍有待探索。
IL-1β 主要由巨噬细胞合成，其释放受到严格调控。与其他细胞因子不同，IL-1β 的无活性前体 pro-IL-1β 必须经过炎症酶 caspase-1 的蛋白水解切割，才能形成生物活性形式的 IL-1β [11]。Caspase-1 由一种称为炎症小体的细胞质多蛋白复合体触发。该复合体包括模式识别受体 (PRR)，属于核苷酸结合和寡聚化结构域 (NOD) 类受体家族 (NLR)，以及一种名为凋亡相关斑点蛋白 (ASC) 的接头蛋白，其中含有 caspase 招募结构域。在已识别的多种炎症小体中，NLR 家族中的吡呤结构域含有 3 (NLRP3) 炎症小体受到了广泛研究，因为它在炎症和抗菌反应中具有多样的功能 [12, 13, 14, 15]。NLRP3 炎症小体的激活通常由多种微生物成分、应激和指示内源性损伤的信号触发。经典的 NLRP3 炎症小体激活需要两个不同的信号：第一个信号（称为启动信号，信号 1）激活转录因子 NF-κB，进而转录上调 NLRP3 和 pro-IL-1β；第二个信号（称为激活步骤，信号 2）直接诱导 NLRP3 复合体的组装，这是通过 caspase-1 介导生物活性形式 IL-1β 分泌所必需的。质膜结合的模式识别受体 (PRRs)，包括 Toll 样受体 (TLR) 和 dectin-1，可以识别各种病原体相关的分子模式 (PAMPs)，从而激活 NF-κB [16]。NLRP3 炎症小体可以通过多种不相关的刺激激活，这些刺激统称为危险相关的分子模式 (DAMPs)，包括活性氧物种 (ROS)、线粒体功能障碍、吞噬溶酶体破坏以及启动步骤后的离子外流 [17]。在之前的研究中，我们发现 L. donovani 通过干扰宿主 A20 蛋白来抑制 NLRP3 驱动的 IL-1β 生成，从而抑制信号 1，从而抑制 NF-κB 的激活。此外，L. donovani 还上调一种线粒体内膜蛋白 uncoupling protein 2 (UCP2)，以减弱信号 2，即线粒体 ROS [10]。
天然存在的 β-葡聚糖 curdlan 通过 dectin-1 介导的 NLRP3 激活和巨噬细胞及树突状细胞内的激活信号发挥其免疫调节作用。先前的研究表明，当使用 curdlan 时，抗 dectin-1 抗体不足以控制 Leishmania 感染 [18]。在之前的研究中，Curdlan 在类似的实验条件下显示出了显著的抗利什曼病和免疫调节作用，且未引起显著的巨噬细胞细胞毒性 [18]。基于这些发现，本研究旨在探讨 Curdlan 介导的 IL-1β 生成和 NLRP3 炎症小体激活的分子机制，特别是在 感染期间。
章节摘录
化学物质和抗体
Curdlan 由 Wako Pure Chemicals (日本大阪) 提供。一级抗体由 Santa Cruz Biotechnology (美国德克萨斯州达拉斯) 和 Cell Signaling Technology (美国马萨诸塞州丹弗斯) 提供。除非另有说明，所有其余试剂和化学品均从 MilliporeSigma (美国圣路易斯) 购买。
细胞培养、寄生虫处理及虫血症评估
小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7 在 37°C 和 5% CO2 的湿度培养箱中培养，使用 RPMI-1640 培养基 (Invitrogen Life Technologies, 美国) 并添加 10%
Curdlan 通过 NO 和 IL-1β 的产生发挥治疗效果
Curdlan 处理 RAW 264.7 细胞后，iNOS mRNA（促进 NO 产生的主要酶）的表达显著增加，这种增加既依赖于剂量也依赖于暴露时间（图 1A）。我们的剂量滴定实验表明，24 小时内 100 μg/ml 的 curdlan 时表达水平达到最大（11.2 倍）。重要的是，本研究中使用的 curdlan 浓度范围先前已被证明对巨噬细胞无毒
讨论
传统化疗的失败和利什曼病中耐药性的出现促使人们开发新的抗利什曼病疗法。使用免疫调节剂为探索高效、安全且易于获得的药物开辟了新途径，通过调节宿主免疫反应来提高治疗效果，特别是通过激活巨噬细胞并帮助有效清除寄生虫。Curdlan 是一种 β
结论
本研究的结果提供了关于 curdlan 免疫调节和抗利什曼病效果的重要见解，这些效果通过两条不同的信号通路实现：(i) 通过 NF-κB 依赖性的 NLRP3 和 pro-IL-1β 的表达；(ii) 通过 ROS 依赖性的炎症小体复合体激活（图 5）。通常，NLRP3 和 pro-IL-1β 的转录由保守的 PAMPs 激活，而 DAMPs 对 IL-1β 的分泌至关重要。
作者声明
作者声明该手稿是原创的，未在其他地方考虑过，已获得作者批准，并且动物实验已获得机构动物伦理委员会批准（协议编号 892/GO/Re/S/01/CPCSEA）。作者声明无利益冲突。
资金支持
本工作得到了 高级研究研究员（扩展）（CSIR 批准编号：09/028(0950)/2015-EMR-I，日期：2015.08.26）、科学与工业研究委员会（印度政府）和国家博士后奖学金（N-PDF）（生命科学）（批准编号：PDF/2016/001370，日期：2017.03.28）的支持。
利益冲突声明
作者声明不存在竞争性财务或非财务利益。
致谢
我们衷心感谢加尔各答大学生物化学系副教授 Anindita Ukil 博士在所有细胞和分子生物学实验中的专业指导。我们也感谢 Kalyani 大学生物化学和生物物理学系的 Tapati Chakraborty 教授提供的多种基础设施支持，包括细胞培养、体内实验、细胞和分子生物学相关实验
Kuntal Ghosh
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