《Farming System》：Genetic engineering approaches to address lignin-related challenges in ruminants feeding: Implications for environmental and animal health
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木质纤维素秸秆作为一种低成本饲料原料，可用于家畜营养。然而，秸秆中较高的木质素含量限制了其可消化性，降低了饲料效率和动物生产力。表达唾液木质素酶的基因修饰反刍动物能够在咀嚼过程中启动木质素降解，从而提高秸秆利用率。本文探讨了木质纤维素降解策略及转基因模型在改善
木质纤维素秸秆作为一种低成本饲料原料，可用于家畜营养。然而，秸秆中较高的木质素含量限制了其可消化性，降低了饲料效率和动物生产力。表达唾液木质素酶的基因修饰反刍动物能够在咀嚼过程中启动木质素降解，从而提高秸秆利用率。本文探讨了木质纤维素降解策略及转基因模型在改善反刍动物饲料效率方面的应用前景。研究发现，作物残渣中木质素含量为2%–21%，每增加1%的木质素，饲料消化率下降3%–5%，同时导致单位饲料甲烷排放增加。全球约20%的稻秆被用于动物饲喂，其余80%被田间焚烧，造成严重空气污染和温室气体排放。传统物理、化学和生物学预处理方法在规模化应用中存在成本高、操作复杂或处理周期长等局限。基因工程则提供了一种精准且可持续的替代方案。通过借鉴已成功开发的表达唾液植酸酶的转基因猪（"Enviropig"）模型，研究人员提出在反刍动物唾液腺中表达合成木质素酶（如来自热双歧菌属的DyP1过氧化物酶、来自枯草芽孢杆菌的CotA漆酶等），利用反刍动物大量唾液分泌和充分咀嚼的生理特点，在口腔阶段即启动木质素解聚。原理验证研究表明，经基因工程改造的哺乳动物唾液细胞能够表达并分泌功能性重组木质素酶，实现体外木质素降解。该策略有望提高纤维消化率、改善养分利用效率、降低肠道甲烷排放，并通过提高秸秆饲料价值减少田间焚烧，从而同时带来环境和动物健康效益。然而，该技术仍处于概念验证阶段，需要进一步开展转基因反刍动物的体内验证、生物安全性评估和监管审批。
以下是论文主体部分的学术性总结，按照原文小标题组织内容：
**1. Introduction**
全球畜牧业面临饲料效率低下和农业环境污染两大挑战。水稻、小麦和玉米等作物秸秆富含木质纤维素，其主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。尽管秸秆具有作为优质饲料的潜力，但高木质素含量与营养成分交联，阻碍了瘤胃细菌对纤维素和半纤维素的利用。作物残渣中木质素含量为2%–21%，饲料中木质素浓度每增加1%，消化率下降3%–5%。消化率降低导致单位饲料的甲烷排放增加，甲烷排放占反刍动物总能量摄入的6%–12%。全球约20%的稻秆被用于动物饲喂，其余80%被田间焚烧，释放甲烷、硫氧化物、PM10和PM2.5、氮氧化物、二氧化碳和一氧化碳等污染物。传统化学预处理、外源酶添加和选择性育种在改善木质纤维素饲料营养价值方面效果有限。基因工程提供了一种更精准持久的解决方案。原理验证研究表明，基因工程改造的哺乳动物唾液细胞能够表达和分泌木质素酶，实现体外木质素降解，为在反刍动物口腔内启动木质素解聚奠定了基础。
**2. Lignin and its role in ruminant nutrition**
木质素是由对羟基苯丙烷、愈创木基丙烷和紫丁香基丙烷三种主要结构单元通过C–O–C和C–C键连接而成的复杂三维多酚聚合物，其中β-O-4键在天然木质素片段中占主导。木质素经苯丙烷代谢途径由松柏醇、芥子醇和对香豆醇等单体木质素醇聚合形成。木质素为植物提供结构强度和保护，但通过共价交联与纤维素和半纤维素形成复杂三维基质，限制结构性碳水化合物对瘤胃微生物的可及性。瘤胃细菌不易降解木质素，厌氧真菌仅能部分降解。高木质素浓度降低纤维降解速率和效率，导致采食量下降、生长速度减慢、产奶量降低。尽管木质素的总能比纤维素高约30%，但其难消化特性延长了纤维在瘤胃中的滞留时间，降低了养分利用效率，同时增加了肠道甲烷排放。木质素利用不足还导致田间焚烧，加剧空气污染和温室气体排放。
**3. Conventional approach for utilization of lignin rich feed**
**3.1. Physical approach**：物理处理包括切碎、研磨、制粒、浸泡和蒸汽爆破等，通过增大表面积和降低颗粒尺寸，提高瘤胃微生物对可发酵细胞壁组分的可及性。然而，精细研磨或制粒会缩短瘤胃滞留时间，反而不利于纤维发酵。水热预处理如热水和蒸汽爆破可破坏半纤维素与木质素之间的连接键，提高材料孔隙率。但规模化应用面临成本、物流和饲料安全性问题。
**3.2. Chemical approach**：化学处理包括氢氧化钠、氨、尿素和石灰处理等。氢氧化钠通过破坏木质素中的酯键和醚键提高消化率，但成本高且有安全风险。氨处理和尿素处理可破坏木质素-碳水化合物键并增加氮含量，提高消化率和粗蛋白水平。石灰处理较温和安全。有机溶剂预处理和氨纤维膨胀可高效脱木质素，但需专用设备和高成本。深共熔溶剂和离子液体具有较高脱木质素效率，但缺乏动物饲喂试验数据且存在溶剂回收和潜在毒性问题。
**3.3. Biological approach**：生物处理利用白腐真菌（如侧耳属、显毛菌属）和细菌（如链霉菌属、红球菌属、假单胞菌属）或其酶（漆酶、过氧化物酶）选择性降解木质素。白腐真菌处理秸秆2-4周可使木质素浓度降低，体外纤维消化率提高10%–30% 。微生物脱木质素通过消除酚类屏障、产生辅助酶（木聚糖酶、阿魏酸酯酶）以及增加水溶性碳水化合物同时降低中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）组分来改善瘤胃发酵。但该方法需要数周 incubation 时间，并需控制温度、湿度和通风，在农场条件下难以规模化应用。酶处理使用漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶等氧化酶改变木质素结构，提高多糖可及性，但酶成本高、固体底物稳定性差、处理时间长，且部分降解产生的酚类副产物可能降低适口性。
**4. Genetic engineering approaches for producing low-lignin forage varieties**
基因工程和诱变技术可开发低木质素植物品种，如褐色中脉（BMR）高粱、玉米、小米等，这些品种持续表现出更高的纤维消化率和更好的反刍动物生产性能。针对木质素途径酶（如肉桂醇脱氢酶CAD和咖啡酸O-甲基转移酶COMT）的精确修饰，以及多重CRISPR/Cas9编辑技术在苜蓿和甘蔗中的应用，已获得木质素积累显著降低且饲草品质改善的品系。CAD催化木质素单体生物合成的最后一步，COMT参与木质素中间体的甲基化，影响紫丁香基木质素单位的组成和比例。育种策略倾向于部分下调或修饰木质素组成而非完全基因敲除，以在消化率和结构完整性之间取得最佳平衡。多环境田间试验和荟萃分析显示，木质素降低持续改善NDF消化率，但存在基因型特异性和环境依赖性农艺限制。
**5. Lesson from genetic engineering for utilization of phytase for better feed utilization**
单胃动物无法代谢植酸磷，导致粪便中磷积累并引起水体富营养化。转基因动物被设计在唾液腺中表达植酸酶，从而实现植酸降解。Golovan等人首先在转基因小鼠中实现了大肠杆菌植酸酶在唾液腺特异性启动子控制下的表达。随后开发的"Enviropig"转基因猪在唾液中分泌功能性植酸酶，使粪便磷排放减少高达75%。猪腮腺分泌蛋白（PSP）启动子被证明能够驱动唾液腺特异性表达。Zhang等人（2018）利用CRISPR/Cas9生成了共表达β-葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶三种微生物酶的单拷贝四顺反子转基因猪，这些酶在唾液腺中稳定表达并可遗传。Yang等人（2023）进一步证明多酶转基因猪在实用日粮条件下粪便磷排放减少45.8%–56.7%。Zhang等人（2024）生成了抗裂解植酸酶转基因猪，解决了消化过程中酶失活的问题。这些研究表明，哺乳动物唾液腺能够大量分泌功能性酶，并在口腔内保持活性，产生可测量的饲料转化和养分排泄改善。
**6. Genetically engineered ruminants for improving the utilization of lignin-rich feed**
**6.1. Scientific rationale and proof of concept for salivary ligninase**：基于植酸酶在小鼠和猪唾液腺中表达的证据，在反刍动物唾液腺中表达木质素酶在生理上具有可行性。木质素酶是胞外氧化酶，释放到唾液中可在进入瘤胃前接触富含木质素的颗粒，破坏木质素-碳水化合物复合物。反刍动物的咀嚼和反刍行为为酶促木质素降解提供了理想条件。Hyder和Kues（2023）的原理验证研究构建了基于Sleeping Beauty转座子的唾液腺特异性木质素酶表达系统，在哺乳动物细胞中稳定表达并分泌重组DyP1木质素酶，并证实其对模型木质素底物的酶活性。这些结果提供了唾液木质素酶在哺乳动物细胞中生产的首次实验概念验证，但仍限于体外验证。
**6.2 Advantages of genetic engineering over existing approaches**：与传统物理化学处理需昂贵工业基础设施不同，基因工程将木质素酶基因永久整合到动物基因组中，转基因始祖动物持续在唾液中分泌活性木质素酶，并通过种系稳定遗传。外源纤维酶在瘤胃中因液体周转率高（约8%–12% h
-1）和瘤胃微生物蛋白水解作用而快速失活，微生物接种剂也会被瘤胃生态系统稀释和取代。相比之下，唾液表达系统避免了这些限制。Enviropig项目尽管未实现商业推广，但证明了腮腺分泌蛋白启动子可驱动异源微生物酶的唾液腺特异性表达。Zhang等人（2018）的CRISPR/Cas9介导转基因猪实现三种微生物酶在腮腺中的稳定可遗传表达，且无明显不良表型。这些研究为开发表达木质素酶的反刍动物提供了坚实的技术基础。
**6.3. Strategies for generating ligninase-expressing transgenic ruminants**：转基因盒包括木质素酶基因、唾液腺特异性启动子、信号肽和筛选标记。原核显微注射法整合随机、效率低（1%–4%），不适合牛等大家畜。体细胞核移植（SCNT）可在胚胎重构前对转基因供体细胞进行完整分子表征，确保后代继承确认的整合事件，已成功用于生产表达人类治疗蛋白的转基因牛和表达多种唾液酶的猪。SCNT是产生木质素酶表达始祖动物的首选策略，但技术难度高，克隆效率低，存在妊娠失败和发育异常风险。合子电穿孔法将转座子木质素酶表达盒直接导入受精卵，操作更快、劳动强度低，可避免克隆相关异常，但无法预验证整合事件。CRISPR/Cas9基因组编辑可进一步实现靶向整合到基因组安全港位点，提高整合精度和表达可预测性。
**6.4. Candidate ligninolytic enzymes and their optimization**：反刍动物分泌大量唾液并进行充分咀嚼，为口腔内木质素降解提供了条件。候选细菌基因包括：来自热双歧菌属的染料脱色过氧化物酶DyP1，具有宽pH（3–10）和温度（2–40°C）范围内的活性；来自类芽孢杆菌JDR2的DyP2，在碱性条件下高活性，与反刍动物唾液微碱性pH相容；来自枯草芽孢杆菌的CotA漆酶，具有优异热稳定性和碱性活性；来自鞘氨醇杆菌T2的超氧化物歧化酶和来自苍白杆菌属的多铜氧化酶。然而，这些天然细菌酶的催化效率、碱性稳定性和分泌相容性可能需要在哺乳动物唾液环境中进一步优化。AlphaFold2和RoseTTAFold等人工智能工具可预测蛋白质三维结构，分子对接和动力学模拟可评估木质素酶-木质素底物在模拟反刍动物唾液条件下的相互作用，从而实现理性设计和筛选优化变体。
**6.5. Cross species applicability of the transgene cassette**：小鼠腮腺分泌蛋白（mPSP）启动子已被证明可在猪中驱动唾液腺特异性表达，猪PSP启动子在小鼠中同样有效，表明PSP启动子活性在哺乳动物物种间保守。CAGGS启动子已在猪和兔的乳腺和外分泌腺中驱动报告蛋白表达，并在大鼠唾液腺细胞中实现木质素酶表达。密码子优化后的木质素酶基因应可在不同家畜物种中表达，因为其催化活性取决于蛋白质结构而非生产物种。因此，同一转基因盒原则上可应用于牛、水牛、绵羊和山羊。
**7. Implications for animal health**
在反刍动物唾液腺中表达功能性木质素酶或提供低木质素饲草，预计可通过提高瘤胃对纤维素和半纤维素的利用，改善能量供应、干物质和纤维消化率及整体生产力。消化改善可缩短饲料在瘤胃中的滞留时间，降低臌胀和酸中毒风险。减少秸秆焚烧可降低大气颗粒物和一氧化碳对动物呼吸系统健康的不利影响。然而，需要实证研究的动物健康因素包括：结构性碳水化合物可利用性增加导致的瘤胃发酵和微生物群落组成变化；唾液腺异位表达外源酶可能引发的局部炎症、黏膜免疫改变或体液免疫反应；酶稳定性与口腔和瘤胃pH及温度的匹配性。来自转基因猪唾液植酸酶的先例表明，在受控条件下唾液表达可兼顾功效和正常生长健康，但每种新酶和新宿主物种都需要专门的安全性、性能和长期福利研究。
**8. Environmental and sustainability benefits**
基因工程通过提高秸秆饲料价值，减少田间焚烧，从而降低二氧化碳、甲烷、氧化亚氮和颗粒物排放。改善饲料消化可减少单位畜产品的饲料需求，降低粪污中未消化养分的排放，并减少单位牛奶或肉产品的肠道甲烷排放。该策略同时带来减少露天秸秆燃烧污染物和降低瘤胃发酵排放的双重环境效益。
**9. Challenges and future prospects**
转基因生物的监管审批是重大挑战，公众对转基因作物和动物的安全性、伦理和贸易影响仍存疑虑。木质素降低与植物完整性之间存在权衡，过度降低可能增加病害易感性和产量损失。转基因动物产生的酶需在瘤胃环境中保持稳定和功能。转座酶和CRISPR-Cas9基因组编辑、合成生物学和系统生物学的进展有望实现更精准的修饰和减少脱靶效应。全面风险评估、长期监测、修订法规和公众参与策略对于该技术的实际应用至关重要。
**Conclusion**
木质素是限制反刍动物有效利用木质纤维素作物残渣的主要屏障，降低饲料消化率和养分利用效率，并导致甲烷排放和残渣焚烧等环境问题。传统预处理和低木质素饲草开发受经济、操作和环境因素限制。新兴基因工程策略，尤其是反刍动物唾液腺中表达木质素酶，是增强木质素降解和改善养分利用的有前景的补充方案。目前证据主要处于概念验证阶段，转基因技术、基因组编辑和合成生物学的发展为未来应用奠定了基础。体内验证、生物安全评估和监管评价是实际实施前必不可少的步骤。
