《Food Bioscience》：Formation Mechanism of Sulfur-Containing Characteristic Volatile Flavor Compounds in Low-Salt Gray Sufu by Methionine Metabolism
编辑推荐：
摘要灰豆腐乳是中国传统发酵豆制品，以其独特的"臭"味而著称。本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）和宏基因组测序，揭示了低盐灰豆腐乳发酵过程中挥发性风味化合物（VFCs）的动态变化及微生物群落的演替规律。共鉴定出84种VFCs，筛选出7
摘要
灰豆腐乳是中国传统发酵豆制品，以其独特的"臭"味而著称。本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）和宏基因组测序，揭示了低盐灰豆腐乳发酵过程中挥发性风味化合物（VFCs）的动态变化及微生物群落的演替规律。共鉴定出84种VFCs，筛选出7种关键特征性VFCs（OAVs ≥ 300）。含硫VFCs，包括三硫化二甲基（DMTS）、二硫化二甲基（DMDS）和甲硫醇（MTL），是灰豆腐乳"臭"味的核心VFCs。半胱氨酸和甲硫氨酸代谢占最高比例（13.87%），这是灰豆腐乳区别于其他类型豆腐乳的一个显著代谢特征。Corynebacterium variabile、Clostridiisalibacter paucivorans、Clostridium rectalis和Kurthia gibsonii在特征性含硫VFCs的形成中发挥了关键作用。作为关键前体，甲硫氨酸经裂解酶和转氨酶催化的裂解和转氨基反应转化为MTL，MTL进一步氧化形成DMDS和DMTS。本研究初步阐明了低盐灰豆腐乳独特"臭"味的形成机制，为豆腐乳的菌种筛选和定向风味调控提供了理论基础。
引言
灰豆腐乳，又称臭豆腐乳，其特征为表面呈灰色或豆绿色，具有独特的风味特征，被形容为"闻着臭、吃着香"。灰豆腐乳营养丰富、口感鲜美且不含胆固醇，富含优质蛋白、游离氨基酸和必需矿物质，因此是植物来源优质蛋白质和钙的优质膳食来源（Song等，2021；Xie等，2019）。与红豆腐乳和白豆腐乳不同，灰豆腐乳的生产不添加Monascus（红曲霉）或香料，通过浸泡在由盐水和水豆腐黄浆混合液（富含硫化物、酯类、醇类、醛类和多酚类化合物）中进行发酵（Sun等，2020；Tian等，2023）。微生物来源追踪分析表明，黄浆、盐水浆和生豆浆是灰豆腐乳发酵系统中细菌的主要来源，而真菌主要来源于豆腐凝乳、盐水浆和生豆浆。这一结果表明，灰豆腐乳的发酵微生物并非完全依赖外源接种，而是在半开放的生产环境中由原料和辅料携带的土著微生物共同形成（Ding等，2023）。在红、白豆腐乳中，香料的添加可以掩盖"臭"味，但同时也会抑制某些功能微生物群落的生长。相比之下，灰豆腐乳不受此类外源香料的干扰，其风味几乎完全来源于复杂微生物群落对大豆蛋白和脂质的大范围降解和转化，从而形成了区别于其他类型豆腐乳的独特风味特征。
挥发性风味化合物（VFCs）是决定豆腐乳整体风味质量的主要因素。红、白豆腐乳的特征性VFCs以丁酸乙酯和己酸乙酯等酯类为主，其次是醇类、醛类和酸类（He等，2020；Xie等，2018）。相比之下，灰豆腐乳在前期发酵阶段的特征性VFCs以醇类和酸类为主，而在后熟阶段则转变为酯类、醇类和含硫/含氮化合物为主要成分（Xie等，2018；Xie等，2024）。酯类可赋予灰豆腐乳花香、果香或蜜香。醇类能够掩盖异味并贡献酒香和果香。相比之下，含硫/含氮化合物具有极低的嗅阈，高浓度时呈现"臭"味，低浓度时则表现为愉悦的香气。豆腐乳和奶酪均以高蛋白为主基质的发酵食品，两者在发酵机制和风味形成途径上存在显著相似性。已有研究证实，奶酪中的含硫VFCs主要来源于含硫氨基酸（尤其是甲硫氨酸）的分解代谢，涉及一系列由裂解酶和转氨酶催化的复杂酶促反应（Ard?，2006；Yvon等，2001）。
豆腐乳中VFCs的形成是一个涉及多种微生物群落协同作用的复杂生化过程，与发酵过程中微生物群落的结构组成和代谢密切相关。先前的研究已证明，Actinomucor elegans和Rhizopus chinensis可能促进豆腐乳中关键VFCs的生物合成，包括苯甲醛、己酸乙酯和吲哚（Liu等，2019）。Leuconostoc（乳杆菌属）、Weissella（魏斯氏菌属）、Debaryomyces（杜氏假丝酵母属）和Pichia（毕赤酵母属）有助于苯乙醛、2-戊基呋喃、辛酸乙酯和癸酸乙酯的形成，赋予豆腐乳主要的果香和花香（Li等，2022）。此外，Lactobacillus brevis（短乳杆菌）可调控豆腐乳的VFCs谱，促进酯类和醇类的合成，尤其是2-甲基丁酸乙酯、苯乙醇和3-甲基丁醇（Hu等，2023）。然而，先前的研究大多局限于微生物与VFCs之间的宏观相关性分析，而特征性VFCs形成的机制，尤其是特定代谢途径的分析，仍远远不足。
市售灰豆腐乳通常采用高盐添加以确保货架稳定性，但过量膳食盐摄入已被证明与多种健康风险相关。低盐发酵更符合当前膳食健康推荐，但也会改变微生物群落结构，从而影响VFCs的形成。目前，大多数关于豆腐乳VFCs谱的研究都集中在红、白豆腐乳上。随着对传统发酵食品风味质量要求的不断提高，深入阐明灰豆腐乳特征性VFCs的形成，尤其是其典型"臭"味的形成机制，引起了学术界的关注。含硫/含氮特征性VFCs是灰豆腐乳"臭"味的核心成分，也是区别于其他类型豆腐乳的关键风味标志物。目前，在无香料干扰的低盐灰豆腐乳中含硫特征性VFCs的形成机制尚未得到充分研究。因此，解析低盐灰豆腐乳中特征性含硫VFCs的微生物代谢机制，对于优质发酵菌种的筛选和豆腐乳风味质量的定向调控至关重要。
本研究采用HS-SPME-GC-MS联合宏基因组测序技术，系统研究了低盐灰豆腐乳发酵过程中VFCs的动态变化和微生物群落的演替规律。进一步基于嗅活值（OAVs）鉴定了关键特征性VFCs，并分析了甲硫氨酸代谢途径，初步阐明了低盐灰豆腐乳中含硫特征性VFCs的潜在形成机制。
章节片段
菌株和化学品
商用Mucor（毛霉）发酵剂购自上海沪酿有限公司（上海，中国）。内标化学品，包括环己酮（CAS 108-94-1）和壬酸甲酯（CAS 1731-84-6）购自Sigma Aldrich贸易（上海）有限公司。
豆腐浆的制作
选取水分含量约为80%的质地均匀、有弹性的豆腐，切成2.5 cm × 2.5 cm × 1.5 cm的立方块。按照发酵剂培养说明配制Mucor（毛霉）孢子悬浮液。在
VFCs的动态变化
采用HS-SPME-GC-MS技术分析了低盐灰豆腐乳发酵过程中VFCs的动态变化。如图1和表S1所示，共鉴定出84种VFCs，包括18种酯类、17种烃类、15种醇类、8种含硫/含氮化合物、8种醛类、6种酮类、5种酸类、4种酚类和3种呋喃类。VFCs类型数量从46种（MP）增加到77种（GS60），其中酯类、烃类、醇类、含硫/含氮化合物和醛类为主要
结论
本研究系统地分析了低盐灰豆腐乳发酵过程中VFCs的动态变化和微生物群落的演替规律。研究发现，其独特的"臭"味主要归因于含硫VFCs，尤其是MTL、DMDS和DMTS。在后熟阶段，包括Corynebacterium variabile（变异棒状杆菌）、Clostridiisalibacter paucivorans（少食梭孢菌）、Clostridium rectalis（直肠梭杆菌）和Kurthia gibsonii（吉本柯尔希亚菌）在内的核心微生物在这些含硫VFCs的形成中发挥了关键作用。
CRediT作者贡献声明
Nannan Yu：调查。Mei Lu：调查。Yinfeng Xu：调查。Shuxin Shi：撰写-审阅与编辑，撰写-原稿，调查，形式化分析。Song Miao：撰写-审阅与编辑，撰写-原稿，方法论，概念构思。Jinhui Hou：撰写-审阅与编辑，资金获取，概念构思。Na Zhang：调查。Chunzhi Xie：撰写-审阅与编辑，撰写-原稿，资源获取，方法论，调查，形式化分析，
未引用参考文献
Gemert，2011；Tian等，2023；Wang等，2023；Xie等，2018；Xie等，2024。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究由贵州战自载技术（集团）有限公司通过"毕节市Gastrodia elata（天麻）Blume的道地性评价与研究"项目和"食品生物技术与功能食品开发"学科方向团队项目资助。
Chunzhi Xie|Shuxin Shi|Yinfeng Xu|Mei Lu|Nannan Yu|Na Zhang|Jinhui Hou|Song Miao
徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏徐州 221018，中国
