超声波结合pH值调节技术提高了银杏籽糖蛋白的功能特性，并降低了其致敏性

《Food Chemistry》：Ultrasonic-combined pH-shifting enhances functional properties and reduces allergenicity of ginkgo seed glycoprotein

　　• 超声波辅助pH值调节（USCPS）技术可以改变GPI的功能特性。• USCPS显著降低了GPI的致敏性。• USCPS显著减少了GPI的N-糖基化水平，尤其是MMX和MMXF。

引言
食物过敏是一个重大的公共卫生问题，影响着全球超过十亿人，其发病率持续上升（Aksoy等人，2021年；Renz等人，2018年）。食物过敏被定义为由食物过敏原（通常是蛋白质）引发的病理性免疫反应，可引发包括呕吐、腹泻、荨麻疹和哮喘等一系列症状；在最严重的情况下，可能会发展成过敏性休克，甚至危及生命。目前，抗过敏药物（如氯雷他定和糖皮质激素）和口服免疫疗法只能缓解症状，而不能根治。长期使用这些药物可能导致药物耐药性和严重的副作用，而口服免疫疗法则受到潜在风险和可及性的限制。尽管严格避免接触食物过敏原可以有效减少过敏反应的发生率（Turnbull等人，2015年），但在日常生活中完全避免接触这些过敏原仍然非常具有挑战性。因此，降低食物过敏原的致敏性已成为食物过敏管理的一个紧迫且关键的战略。

银杏叶富含多种生物活性成分，如蛋白质、多糖和黄酮类化合物，具有重要的营养价值，并被广泛应用于制药和食品工业（Wang & Zhang，2019年）。作为银杏叶中第二丰富的营养成分，银杏叶蛋白分离物（GPI）不仅具有清除羟基自由基、1,1-二苯基-2-ピクリルヒドラジル（DPPH）自由基和超氧阴离子自由基的能力，还具备多种生物活性，包括抗肿瘤和抗菌特性（Huang等人，2010年；Sawano等人，2007年；Wang & Ng，2000年；Zhou等人，2019年）。此外，GPI表现出优异的功能特性（如持水能力（WHC）、溶解性、起泡能力和乳化能力），使其作为功能性食品成分具有巨大潜力（Deng等人，2011年）。然而，直接食用或过量摄入GPI可能会引起恶心、呕吐、腹痛等临床症状，在严重情况下甚至可能导致死亡（Sun & Yang，2019年）。从银杏叶中已分离出三种分子量分别为21kDa、32kDa和36kDa的致敏性糖蛋白（Zhou等人，2016年）。GPI的致敏性已成为限制其在食品中应用的关键因素。

多种食品加工技术（如酶水解、美拉德反应、超声波（US）、高压和微波）可以通过引起蛋白质聚集、变性或其他化学修饰来作用于致敏性糖蛋白，从而破坏或掩盖致敏表位，降低蛋白质的致敏性（Arteaga-Marin等人，2025年；Ding等人，2021年；Liu等人，2023年）。例如，使用碱性酶对蚕蛹致敏蛋白进行酶水解后，免疫小鼠没有出现明显的过敏症状，并且血清抗体、组胺和Th2相关细胞因子显著减少（Dai等人，2023年）。ELISA结果显示，花生过敏原Ara h 2.01与木糖发生美拉德反应后，部分表位被覆盖，导致致敏性显著降低（He, Chen等人，2024年）。此外，在300–700 MPa的高压处理下，不仅显著降低了GPI的致敏性，还提高了其热稳定性和乳化性能（Kobayashi等人，2011年）。在食品工业中， keeping降低蛋白质的致敏性同时保留其营养价值和功能特性已成为核心研究目标。

作为一种绿色蛋白质修饰技术，超声波主要通过破坏蛋白质表面的构象表位和掩盖表位来调节蛋白质的致敏性。例如，高强度超声波可以破坏猕猴桃Act d 2过敏原和虾肌球蛋白过敏原的二级结构，显著降低它们的IgE结合能力（Dong等人，2020年；Wang等人，2021年）。然而，超声波处理的效果因实验条件而异：一些研究表明，超声波可能会使致敏表位暴露，从而无法有效降低致敏性，就像桃子Pru p 3过敏原的情况一样（Tobajas等人，2023年）。近年来，超声波预处理与其他加工技术结合（USPCT）因其协同效应而受到广泛关注。超声波预处理在所有USPCT方法中都起到了积极作用。例如，β-乳球蛋白（β-Lg）经过不同功率的超声波预处理后再进行半乳糖糖基化后，其IgE/IgG结合能力、β-己糖胺酶释放以及组胺和白细胞介素-6水平显著降低，同时二级和三级结构也发生了变化。这些结果证实了USPCT是降低蛋白质致敏潜力的有效方法（Shao等人，2020年）。值得注意的是，pH值调节技术作为一种有用的蛋白质修饰策略，可以增强银杏叶蛋白分离物（GPI）的功能特性（Zhang等人，2021年）。然而，单独使用pH值调节进行蛋白质处理往往无法达到预期效果（Igartúa等人，2024年）。因此，我们假设结合超声波和pH值调节可能会产生互补的结构效应，即pH值诱导的构象重排可以增加蛋白质结构对后续超声波修饰的敏感性，从而可能比单独使用任一方法产生更明显的变化。基于此，本研究选择了超声波与pH值调节相结合的方法来修饰GPI，并研究其对功能特性和致敏性的影响。

几乎所有植物来源的致敏性糖蛋白都经过N-糖基化，其N-糖链在IgE介导的过敏反应中起着重要作用。例如，通过对花粉中的致敏性糖蛋白进行脱糖处理后，IgE与这种致敏蛋白的相互作用完全消失，表明这种相互作用主要依赖于N-糖链（álvarez等人，2025年）。研究表明，N-糖链直接参与过敏反应中IgE抗体的识别过程（Swoboda & Breiteneder，2023年）。与哺乳动物糖蛋白的N-糖链不同，植物糖蛋白的N-糖链具有独特的α1,3-连接的核心岩藻糖和β-1,2-连接的木糖残基修饰，这些是交叉反应性碳水化合物决定簇（CCDs）。通过用辣根过氧化物酶（HRP）免疫兔子产生的重组IgE（rIgE）可以特异性识别携带CCDs的糖蛋白（例如HRP、蜂毒提取物和油菜花粉），但不能识别缺乏CCDs的黄蜂毒蛋白（Plum等人，2023年）。因此，致敏性糖蛋白的N-糖链可以作为抗原表位，特异性地识别并结合到嗜碱性粒细胞表面的IgE–FcεRI复合物上，在IgE介导的过敏反应中起关键作用。然而，联合USCPS处理对银杏叶中致敏性糖蛋白的N-糖基化水平的影响尚不清楚。

基于以上考虑，本研究旨在探讨USCPS处理对GPI的功能特性和致敏性的影响，以及糖基化修饰的潜在作用。首先，确定了处理前后GPI的物理化学性质和功能特性。通过使用Balb/c小鼠作为动物模型，随后通过检测小鼠的过敏相关症状明确了USCPS处理对GPI致敏性的调节作用。最后，使用我们研究小组建立的“一体法”分离并标记了GPI及其处理样品（GPI-12-UPPI）中的N-糖链，并通过HILIC–LC–MS进行了分析。本研究为阐明GPI中N-糖链的致敏机制提供了理论基础，也为深入开发GPI资源和调节食物致敏性提供了科学参考。

材料与试剂
银杏（Ginkgo biloba L.）种子购自中国山西太原的农贸市场。1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）从Sigma公司（美国密苏里州圣路易斯）购买。固相萃取用石墨碳柱（GCC，200 mg/3 mL）和C18 SPE柱（200 mg/3 mL）从Sigma Aldrich（德国）购买。其他化学品和试剂均为最高纯度的产品。

银杏叶蛋白的制备
GPI的分离和纯化方法参考了相关文献（Li等人，2010年）。简而言之，新鲜的银杏叶...

GPI和GPI-12-UPPI的功能特性
蛋白质的功能特性在食品加工中起着至关重要的作用，因为它们可以影响食品的粘度、口感和质地。在本研究中，检测了GPI和GPI-12-UPPI的持水能力（WHC）、氧结合能力（OHC）、乳化能力和起泡能力（结果见图1）。图1A和B显示了超声波和pH处理对GPI的WHC和OHC的影响。天然GPI的WHC为1.84%，明显高于GPI-12-UPPI的0.51%（p < 0.001）。

讨论
在本研究中，USCPS处理显著提高了GPI的OHC（1.65倍）和FC（0.98倍），同时降低了其WHC（0.72倍）和FS（0.08倍）（图1）。这一结果与Tang等人（Tang等人，2024年）的研究结果一致，他们也观察到通过交替超声波/碱处理提取玉蜀黍蛋白时功能特性有所改善。另一项研究也证实，与单独的pH值调节或超声波处理相比，USCPS处理...

结论
在本研究中，我们系统地分析了USCPS处理前后GPI的物理化学性质、功能特性和致敏性的差异。我们还对其N-糖链进行了定性和定量分析，并使用分子对接技术进一步探讨了GPI的主要N-糖链成分MMX和MMXF与抑制受体FcγRIIB的结合情况。结果表明，USCPS处理...

动物实验
本研究遵循了ARRIVE（Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments）指南进行。本研究获得了西北大学实验动物管理和伦理委员会的批准（批准号NWU-AWC-20231007M）。

作者贡献声明
Cheng Li：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、资金获取、数据管理、概念构思。Yuexin Yu：方法学。Jing Jing：方法学。Bo Li：资源提供。Huizhen Li：监督、研究、资金获取。Linjuan Huang：监督、研究、资金获取。Zhijun Zhang：监督、研究、资金获取。

未引用参考文献
Wang, Hu, Cai, Voglmeir and Liu, 2017

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的潜在财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢
本工作得到了中国博士后科学基金（项目编号2025M783021）和关键技术研究开发计划（项目编号2024YFD1600100）的支持。

Cheng Li | Yuexin Yu | Jing Jing | Bo Li | Huizhen Li | Linjuan Huang | Zhijun Zhang