多组学揭示膳食花生四烯酸重塑拟穴青蟹肝胰腺脂质并调节类固醇生成相关通路

《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Multi-omics reveals that dietary arachidonic acid reshapes hepatopancreatic lipid remodeling and modulates steroidogenesis-related pathways in mud crab

　　

本研究首次对膳食花生四烯酸（arachidonic acid, ARA）调控拟穴青蟹（Scylla paramamosain）进行了转录组学-脂质组学整合分析。膳食ARA重塑了肝胰腺脂质组成以及甘油三酯（triacylglycerol, TG）、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE）中的脂肪酸位置分布。在最优ARA水平下，增强的抗氧化能力与长寿调控信号通路相关。ARA诱导的胆固醇酯（cholesterol ester, ChE）和甘油酯重塑与卵巢类固醇生成相关。

膳食花生四烯酸重塑拟穴青蟹肝胰腺脂质并调节类固醇生成相关通路——多组学联合解读

花生四烯酸（arachidonic acid, ARA; 20:4n-6）是一种具有重要生物活性的长链多不饱和脂肪酸，广泛参与脂质代谢、免疫调节和生殖过程调控。在甲壳动物中，ARA作为二十烷酸类信号分子的前体，其生理功能受到越来越多的关注。然而，对于内源合成ARA能力有限的物种而言，膳食ARA被视为必需脂肪酸，其在人工配合饲料中的适宜添加水平直接影响养殖动物的生长性能和健康状况。拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是我国重要的海水养殖经济物种，此前研究已表明适量膳食ARA可促进其生长性能、抗氧化能力和卵巢发育，但ARA如何协调肝胰腺脂质代谢与类固醇生成之间的分子连接机制仍不清楚。为此，研究人员提出科学假设：膳食ARA可能通过重塑肝胰腺脂质组成，进而调节与卵巢类固醇生成相关的信号通路。为验证这一假设，本研究采用转录组学与脂质组学平行分析策略，系统考察了膳食ARA对拟穴青蟹肝胰腺的分子调控效应，旨在揭示脂质代谢与类固醇生成之间的潜在关联。

研究人员选用宁波大学养殖设施内的144只幼蟹（约10 g），随机分配至6个等氮等脂膳食处理组（H1至H6），对应实测ARA含量分别为0.04%、0.25%、0.46%、0.89%、1.25%和1.57%，开展为期22周的喂养实验。基于前期研究结果，选取H1（最低）、H3（最优）和H6（最高）三个代表性处理组进行多组学分析，每组设3个生物学重复。实验结束后采集肝胰腺组织，分别进行转录组测序和非靶向脂质组学分析。转录组学采用MGISEQ-T7平台进行双端150 bp测序，利用HISAT2比对至参考基因组，DESeq2鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并开展KEGG通路富集分析，同时采用实时荧光定量PCR验证关键基因表达。脂质组学采用甲基叔丁基醚法提取总脂，通过超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱联用技术（UPLC-Q Exactive MS）在正负离子模式下采集数据，利用LipidSearch软件进行脂质分子物种鉴定，结合多元统计分析与FDR校正筛选差异脂质。

转录组分析结果显示，各组测序数据质量良好，样本间生物学重复一致性较高。主成分分析显示H1、H3和H6三组呈现明显分离。DEGs鉴定结果表明，H3 vs H1比较组共获得1883个DEGs，其中1220个上调、663个下调；H6 vs H1比较组共获得1414个DEGs，其中793个上调、621个下调；H6 vs H3比较组获得1612个DEGs，其中570个上调、1042个下调。KEGG富集分析显示，H3 vs H1中上调基因主要富集于咖啡因代谢、长寿调控通路和吞噬体等通路，下调基因主要富集于长寿调控通路、硒化合物代谢和丁酸酯代谢等通路；H6 vs H1中上调基因主要富集于Toll和Imd信号通路、MAPK信号通路和造血细胞谱系等通路，下调基因主要富集于磷酸戊糖途径、糖胺聚糖降解和产热等通路。进一步将DEGs映射至代表性KEGG通路发现，脂肪酸转运相关基因acs在PPAR信号通路中显著下调，抗氧化相关基因sod、sod2和sod3在长寿调控通路（多物种）中显著上调，而pla2和artist在类固醇生成相关通路中显著上调。RT-qPCR验证结果与转录组测序数据一致，确认了转录组结果的可靠性。

脂质组分析共注释到5699个脂质分子特征，归属于44个脂质亚类，其中主要亚类包括甘油三酯（triacylglycerol, TG; 22.3%）、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC; 13.6%）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE; 9.0%）、甘油二酯（diacylglycerol, DG; 8.8%）、己糖神经酰胺（Hex1Cer; 7.5%）和神经酰胺（ceramide, Cer; 7.4%）。脂质类别丰度分析显示，与H1相比，H3组中PC、PE、溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine, LPC）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）磷酸化衍生物、溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid, LPA）、酵母甾醇酯（zymosterol ester, ZyE）、蜡酯（wax ester, WE）、O-酰基-1-羟基脂肪酸（OAHFA）、己糖神经酰胺、神经酰胺、鞘磷脂（sphingomyelin, SM）、神经酰胺磷酸（ceramide phosphate, CerP）、含植物鞘氨醇鞘磷脂（phytosphingosine-containing sphingomyelin, phSM）、N-乙酰己糖神经酰胺（CerG2GNAc1）、鞘氨醇磷酸（sphingosine phosphate, SPHP）、溶血鞘磷脂（lysosphingomyelin, LSM）和辅酶Q（coenzyme Q, Co）等18个亚类的相对丰度显著降低；H6组中DG、PC、PE、LPC、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine, LPE）、溶血磷脂酰丝氨酸（lysophosphatidylserine, LPS）、溶血磷脂酰甘油（lysophosphatidylglycerol, LPG）、LPA、胆固醇酯（cholesterol ester, ChE）、ZyE、豆甾醇酯（stigmasterol ester, StE）、WE、OAHFA、Hex1Cer、Cer、SM、CerP、phSM、SPHP、三己糖二-N-乙酰己糖神经酰胺（CerG3GNAc2）和Co等22个亚类的相对丰度显著降低。差异脂质分子筛选结果表明，H3 vs H1比较组获得81个差异分子物种（64个增加、17个减少），H6 vs H1比较组获得314个差异分子物种（234个增加、80个减少）。在H3 vs H1中，PE、PC、TG、LPC、Hex1Cer、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）、DG、LPE、心磷脂（cardiolipin, CL）、游离脂肪酸（fatty acid, FA）、溶血磷脂酰肌醇（lysophosphatidylinositol, LPI）、LPS和SM类中部分分子物种丰度增加，而磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol, PG）类在H1中较高。在H6 vs H1中，TG、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）、PG、DG、PS、Hex1Cer、酰基肉碱（acylcarnitine, AcCa）、甾醇（sterol, ST）、Cer、CL、FA和鞘氨醇（sphingosine, SPH）类中部分分子物种丰度增加，而LPC和Co在H1中较高。上述结果表明膳食ARA显著改变了肝胰腺主要脂质类别的分子组成。

转录组与脂质组的联合比较解读发现，尽管两个数据集独立分析，但均一致指向胆固醇代谢、花生四烯酸代谢和类固醇生成相关生物学过程。acs在PPAR信号通路中的下调与肝胰腺脂质合成减少的脂质组学特征相呼应；sod基因家族的上调支持ARA增强抗氧化能力的生理效应；pla2和artist在类固醇生成通路中的上调提示ARA可能通过磷脂酶A2介导的膜磷脂释放和硫酯酶介导的花生四烯酰-CoA水解，增加游离ARA供给以支持类固醇激素合成。然而，研究人员强调，当前分析尚未建立DEGs与特定脂质分子之间的直接因果联系，上述关联应视为生物学关联而非机制证据。膳食ARA可能通过协同调控脂质代谢基因表达和脂质分子组成来影响类固醇代谢过程，但该假说仍需通过类固醇激素定量、酶活测定、代谢流分析和功能干预实验加以验证。本研究提供了膳食ARA调控拟穴青蟹肝胰腺脂质重塑和类固醇生成相关通路的探索性多组学数据集，为后续开展目标导向的营养调控机制研究奠定了重要基础。