《Food Chemistry: X》：Insights into differences in oxidation and interaction of main components in porcine and bovine milk during refrigerated storage
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本研究考察了猪乳（PM）和牛乳（BM）在4°C下储存6天期间的组分氧化及相互作用。与BM相比，PM呈现出更高水平的脂质氧化产物、蛋白羰基和表面疏水性（P < 0.05），并伴随蛋白质聚集，表明PM经历了更广泛的脂质和蛋白质氧化。相比之下，BM显示出更高的3-脱
本研究考察了猪乳（PM）和牛乳（BM）在4°C下储存6天期间的组分氧化及相互作用。与BM相比，PM呈现出更高水平的脂质氧化产物、蛋白羰基和表面疏水性（P < 0.05），并伴随蛋白质聚集，表明PM经历了更广泛的脂质和蛋白质氧化。相比之下，BM显示出更高的3-脱氧葡萄糖酮（3-DG）和D-葡萄糖酮（GLO）积累、更大的巯基损失、增强的荧光强度以及波动的粒径，提示碳水化合物氧化和糖化反应占主导。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）鉴定出表面疏水性、硫代巴比妥酸反应物（TBARS）、粒径和巯基基团可作为区分PM与BM氧化状态的关键指标。PM中TBARS与粒径、羰基和巯基含量显著相关（P < 0.05），而BM中表面疏水性与3-DG和GLO含量显著相关（P < 0.05）。因此，PM的脂质氧化与蛋白质变化相关联，而BM中这类变化则与碳水化合物氧化和糖化反应驱动的糖化作用同步进行。
**冷藏储存期间猪乳与牛乳主要组分氧化与相互作用差异的研究解读**
**研究背景与目的**
牛乳（BM）富含蛋白质、脂质、碳水化合物、多种矿物质和维生素，营养丰富，目前是全球婴幼儿配方奶粉的主要乳源。然而，在许多国家，生乳在挤奶后无法立即加工，通常需要一段额外的储存时间。在储存期间，生乳中的主要营养成分如脂质、蛋白质和碳水化合物之间会发生复杂的化学反应，这是导致功能特性劣化、营养价值下降、不良风味形成甚至有害物质生成的主要原因。
在生乳储存过程中，碳水化合物氧化、糖化反应或脂质氧化可产生具有反应活性的α-二羰基化合物（如乙二醛、甲基乙二醛、D-葡萄糖酮、3-脱氧葡萄糖酮等），这些化合物对亲核基团（如赖氨酸、精氨酸等残基）具有高度反应活性。同时，脂质氧化产物也可与上述亲核氨基酸残基相互作用，进一步导致蛋白质空间构象改变、功能基团失活甚至蛋白质聚集。此外，α-二羰基化合物可与蛋白质反应形成晚期糖化终末产物（AGEs）。在冷藏条件下，还会发生蛋白质变性、聚集和交联，这些都可能改变蛋白质结构，进而导致营养成分减少。
目前研究生乳储存稳定性的工作主要集中在常见大型哺乳动物乳源如牛乳、羊乳和骆驼乳，而关于猪乳的系统性研究较少。猪乳因其独特的营养成分而受到广泛关注，其蛋白质和脂质含量显著高于人乳和牛乳，且寡糖含量更接近人乳。由于猪乳与牛乳在营养特性上存在显著差异，从主要组分相互作用的角度对两者进行系统比较的研究尚属空白。因此，本研究旨在比较来自常规商业牧场的猪乳和牛乳在冷藏储存期间的主要组分变化，探索两者差异氧化及相互作用模式的潜在机制。
**主要技术方法**
研究人员从沈阳市某猪场采集猪乳（n=40，产后15-20天成熟乳），从沈阳市某现代化牧场采集牛乳（n=40）。将各组内个体样本合并成混合乳样以减小个体差异，取310 mL等分试样在4°C储存6天，每隔1天采样一次，样品命名为PM0/BM0至PM6/BM6（0天为初始时间点）。采用乳成分分析仪测定基本组成；使用POV和TBARS评估脂质氧化程度；采用L-8900全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量；通过DNPH衍生化法测定蛋白质羰基含量；利用Ellman试剂法测定巯基含量；以ANS荧光探针法测定表面疏水性；采用荧光分光光度计检测内源荧光强度；使用粒度及Zeta电位分析仪测定粒径；通过SDS-PAGE分析蛋白质交联与分子量变化；采用超高效液相色谱-串联质谱法定量α-羰基化合物。统计分析采用SPSS 25.0软件进行方差分析、Pearson相关分析和t检验，使用Simca-p 14.0进行OPLS-DA判别分析，OriginPro 2024进行数据可视化。所有样品均进行三次平行分析。
**研究结果**
*3.1 脂质氧化程度分析*
猪乳的POV值显著高于牛乳（P < 0.05），这归因于物种间脂肪酸组成的差异——猪乳含有更高比例的长链多不饱和脂肪酸，而牛乳富含饱和脂肪酸，因此猪乳更容易发生氧化。储存期间，POV和TBARS值均先升后降，表明脂质氢过氧化物作为不稳定的初级氧化产物会分解为醛、酮等次级产物，TBARS值的降低可能与后续聚合、挥发或与蛋白质发生糖化反应有关。猪乳的TBARS值显著高于牛乳（P < 0.05），且提前达到最大值，表明猪乳的脂质氧化进程在储存期间更为深入。
*3.2 氨基酸含量分析*
猪乳中17种氨基酸含量显著高于牛乳（P < 0.05），其中谷氨酸和脯氨酸尤为突出，猪乳的赖氨酸、精氨酸和亮氨酸水平也显著高于牛乳。随着储存时间的延长，牛乳氨基酸含量持续增加，而猪乳氨基酸含量先升高至第5天达峰值后下降。这种差异与原料乳的组成有关：猪乳较高的不饱和脂肪酸在氧化过程中产生大量活性羰基化合物，进一步与蛋白质中的亲核基团反应，促进晚期脂质氧化终产物形成并加速氨基酸消耗。
*3.3 羰基含量分析*
猪乳的羰基含量显著高于牛乳（P < 0.05），表明猪乳蛋白质氧化程度更高。这一差异部分归因于两种乳的蛋白质组成不同，以及脂肪和金属离子含量的差异。猪乳较高的脂肪含量和不饱和脂肪酸比例使其更易发生脂质氧化，产生攻击蛋白质亲核基团的活性羰基物种；此外，猪乳中铁和铜的浓度分别约为牛乳的2倍和4倍，这两种金属离子均为促氧化剂，即使在冷藏条件下也能催化Fenton反应产生羟自由基，进一步加速蛋白质氧化。值得注意的是，早期阶段猪乳羰基含量的快速下降与氨基酸含量降低相平行，提示新形成的活性羰基物种可能与包括游离氨基酸在内的内源氨基化合物发生亲核加成反应，从而降低游离羰基浓度。
*3.4 巯基含量分析*
牛乳在0-4天期间巯基含量急剧下降63.84%，而猪乳巯基初始值仅为牛乳的9.60%，且呈现轻微波动上升28.17%。这一根本差异源于两种乳的蛋白质组成和结构差异：牛乳游离巯基主要来源于β-乳球蛋白，其Cys-121位点在储存早期极易被氧化消耗；而猪乳中β-乳球蛋白含量低且其结构本身缺乏游离巯基，因此初始巯基水平极低并在储存期间保持稳定，轻微波动可能归因于其他蛋白质的构象变化。
*3.5 表面疏水性分析*
猪乳和牛乳的表面疏水性在整个储存期间均呈持续增加趋势（P < 0.01）。氧化改变了蛋白质构象，导致蛋白质内部疏水区域暴露，为ANS探针提供了更多结合位点。猪乳中的脂质氧化产物能与蛋白质形成不可逆共价加合物，破坏蛋白质天然紧密折叠构象，暴露埋藏的疏水基团，导致猪乳的H?始终高于牛乳。脂质氧化诱导的蛋白质变性和共价修饰是造成两者H?差异的关键因素。
*3.6 内源荧光强度分析*
猪乳和牛乳的荧光强度在储存期间总体呈上升趋势，反映了氧化过程中蛋白质结构变得松散，更多疏水性氨基酸残基暴露。但猪乳的荧光强度显著低于牛乳（P < 0.05），这主要是因为猪乳中发生了更强烈的脂质氧化-蛋白质共氧化过程，脂质氧化产生的活性自由基容易攻击乳蛋白中的色氨酸等荧光氨基酸残基，导致荧光猝灭。
*3.7 粒径变化分析*
随着储存时间延长，牛乳粒径先增大后减小，而猪乳粒径保持相对稳定。与猪乳相比，牛乳粒径值显著更高（P < 0.01），这与其较高比例的胶体磷酸钙酪蛋白有关。猪乳酪蛋白胶束较小的粒径和表面丰富的负电荷增强了空间位阻和静电排斥，间接改善了脂肪球分散稳定性。猪乳中更小的脂肪球具有更大的比表面积，有利于酶接触，促进脂质水解和吸收。
*3.8 SDS-PAGE分析*
猪乳样品在>100 kDa的高分子量区域出现清晰条带，证明形成了稳定的共价交联高分子量聚合物；而牛乳样品中未出现这些条带，表明相同储存条件下牛乳蛋白质间的共价交联程度显著低于猪乳。猪乳酪蛋白胶束粒径较小且κ-酪蛋白含量较高，后者更易通过疏水相互作用发生非特异性聚集。猪乳高脂质和高蛋白含量的结构特征共同营造了有利于氧化和聚集的基质环境。
*3.9 α-羰基化合物含量分析*
实验过程中乙二醛和甲基乙二醛未被检测到，可能归因于它们快速参与反应导致积累不足。牛乳的GLO和3-DG水平显著高于猪乳（P < 0.01），且在储存期间逐渐增加（P < 0.05）。虽然猪乳寡糖含量是牛乳的13.8倍，但寡糖的分子尺寸和空间位阻大于乳糖，不利于氧化和糖化反应发生；猪乳中较高水平的不饱和脂肪酸可抑制碳水化合物氧化。由于4°C低温阻碍了糖化反应进程，6天储存时间不足以使反应中间体完全转化为可检测的AGEs。
*3.10 OPLS-DA模型判别分析*
OPLS-DA模型的R2Xcum、R2Ycum和Q2cum值分别为0.723、0.985和0.980，拟合优度良好。200次排列检验的R2Y（0.00263）和Q2Y（?0.314）均< 0.1，确保模型不存在过拟合。VIP > 1的变量包括H?（1.20477）、TBARS（1.13696）、粒径（1.11276）和巯基（1.09142），被鉴定为区分猪乳和牛乳氧化状态的关键指标。
*3.11 氧化指标间相关性分析*
猪乳与牛乳呈现出截然不同的相关模式。在猪乳中，TBARS与粒径、羰基和巯基显著相关，进一步证实了猪乳中羰基积累与其脂质氧化过程密切相关。鉴于猪乳中不饱和脂肪酸含量较高，研究人员推测这些不饱和脂肪酸在储存期间可通过脂质氧化途径驱动蛋白质氧化和糖化反应。在牛乳中，H?与3-DG和GLO含量呈显著正相关，表明糖化反应促进了蛋白质侧链展开，暴露更多疏水基团；POV与粒径显著负相关、与巯基含量强正相关，表明脂质氧化并未直接引起明显的蛋白质氧化损伤，而是与蛋白质聚集状态变化相关，可能通过促进蛋白质分散和暴露部分巯基来间接调节糖化反应的进程和产物积累。两种统计方法识别的关键指标高度重叠，相互验证了H?、TBARS、粒径和巯基在反映乳体系氧化和糖化过程中的关键作用。
**结论**
本研究系统考察了来自商业牧场的猪乳和牛乳在储存期间蛋白质氧化、脂质氧化和糖化反应的动态过程，鉴定出两种原料乳主要氧化途径的差异。猪乳的初级和次级脂质氧化产物水平、羰基含量、表面疏水性和高分子量聚集程度显著高于牛乳，而牛乳的巯基含量、内源荧光强度、3-DG和GLO含量显著更高，且粒径先增大后波动下降。OPLS-DA模型鉴定出表面疏水性、TBARS、粒径和巯基是与差异相关的关键指标。相关性分析显示，猪乳中TBARS与粒径、羰基和巯基显著相关，而牛乳中H?与3-DG和GLO呈显著正相关。这些发现表明，储存期间猪乳和牛乳的氧化途径显著不同：猪乳以脂质氧化为主导，表现为蛋白质与脂质的共氧化；牛乳则与碳水化合物氧化和糖化反应相关，呈现蛋白质结构变化与糖化中间产物积累的协同增加。此外，猪乳较高的氨基酸含量和较小的脂肪球粒径提示其在营养保留和消化特性方面具有一定优势。该研究表征了冷藏条件下猪乳和牛乳的氧化途径及相互作用模式，探索了其差异行为的潜在机制，为不同乳源在乳制品中的储存稳定性和进一步利用提供了参考。
