正交液相色谱-原子荧光光谱法针对超富集与非超富集植物中硒形态分析的差异提取策略

《Food Chemistry: X》：Differentiated extraction strategies for selenium speciation in hyperaccumulator and non-hyperaccumulator plants via orthogonal LC-AFS

　　

随着硒(Se)强化产品需求的增长，亟需准确且可及的硒形态分析方法。本研究建立了一种经济高效的 Orthogonal Liquid Chromatography-Atomic Fluorescence Spectrometry（正交液相色谱-原子荧光光谱法，LC-AFS）方法，用于测定七种硒形态（SeO32?、SeO42?、Selenolanthionine（硒羊毛硫氨酸，SeLan）、Selenomethionine（硒代蛋氨酸，SeMet）、Selenocystine（硒胱氨酸，SeCys2）、Methylselenocysteine（甲基硒代半胱氨酸，MeSeCys）和 γ-Glutamylmethylselenocysteine（γ-谷氨酰甲基硒代半胱氨酸，γ-GluMeSeCys）），作为基于电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）方法的替代方案。超富集植物 Cardamine hupingshanensis（壶瓶山碎米荠）与非超富集小麦在硒积累机制上的差异显著影响了提取效率。序贯水-酶提取使 C. hupingshanensis 中 SeLan 回收率从 5.06 提升至 143.74 μg Se g?1（28.4 倍），而厌氧提取使小麦中 SeMet 回收率从 98.73 提升至 112.17 μg Se g?1。据此，基质特异性策略将 C. hupingshanensis 硒总回收率从 20.82% 提升至 80.65%，小麦从 34.11% 提升至 90.02%。这些发现凸显了基质特异性提取对准确硒形态分析的重要性。

研究背景与立项依据：硒是人体必需微量元素，参与抗氧化防御与甲状腺激素代谢，但缺硒仍具广泛健康风险，硒强化食品因有机硒形态生物利用度高、毒性低而受关注。植物硒生物强化中，超富集植物（如壶瓶山碎米荠 Cardamine hupingshanensis，干物质硒可达 8000 mg kg^?1）主要将硒转化为游离硒代氨基酸（Se-AAs）如 MeSeCys、SeLan 用于贮存解毒；非超富集作物（小麦、水稻）则将无机硒同化为 SeMet、SeCys₂ 并非特异性掺入蛋白质。现有强阴离子交换（SAX）色谱联用 ICP-MS 或 AFS 的方法难以覆盖 SeLan 与 γ-GluMeSeCys，且 ICP-MS 成本高制约常规应用，AFS 多限于 SAX 体系；同时传统“一刀切”酶解提取忽视不同基质硒存贮形式，导致易降解或释放不全。为此，研究人员在《Food Chemistry: X》报道了整合 SAX/SCX（强阳离子交换）正交色谱与 AFS 检测、并依基质差异设计提取流程的系统性研究，旨在提供低成本、广覆盖、高回收率的植物硒形态分析平台。

主要关键技术方法：研究以壶瓶山碎米荠水培苗（80 mg Se L^?1 以 SeO₃^2? 形式处理 14 天）与扬州大学提供的小麦籽粒（土壤添加 40 mg Se kg^?1 以 SeO₄^2? 形式处理至抽穗后 31 天）为样本队列。总硒经 HNO₃/H₂O₂ 消解由 ICP-MS 定量；形态分离采用 Hamilton PRP-X100 SAX 柱（分离 SeO₃^2?、SeO₄^2?）与 Zorbax 300-SCX 柱（梯度洗脱分离五种有机硒代氨基酸）正交组合，柱后直接耦联 AFS（氢化物发生-氩氢焰检测）。提取端比较了水浴震荡（WB）、超声水浴（WU）、探头超声（UP）辅助蛋白酶 XIV 水解，以及先纯水超声提取游离 Se-AAs 再酶解残渣的序贯提取；部分实验在氮氛围手套箱（O₂<<5 ppm）厌氧操作，酶解液经 10 kDa 超滤纯化后进样。

研究结果（保留原文小标题结构）：

3.1 正交 LC-AFS 对七种硒形态的分离：SAX 柱上 SeLan、SeCys₂ 与实验室氧化制备的 SeOMet 共洗脱，证明需 SCX 互补。优化 SCX 流动相（1 mM 与 40 mM 甲酸吡啶缓冲液 pH 2.2，90% A 等度起始）实现 γ-GluMeSeCys、MeSeCys、SeMet、SeLan、SeCys₂ 13 min 内基线分离；SAX 侧 40 mM 磷酸铵 pH 6.0 分离两种无机硒。七点外标曲线 R²>0.9950，SeO₃^2? LOD 0.38 ng mL^?1，Se-AAs LOD 3.16–12.42 ng mL^?1，方法精度 RSD<4.14%。

3.2 辅助酶提策略比较：在 C. hupingshanensis 中三种辅助方式对游离 Se-AAs 提取无显著差异（WU 对 SeCys₂ 略高）；小麦中 WB 法 SeMet 提取优于 WU 和 UP，总回收由 UP 的 34.11% 升至 WB 的 52.21%，说明辅助酶提优化主要利于蛋白结合硒释放。

3.3 序贯提取策略建立：C. hupingshanensis 单步酶解仅获 23.26% 回收且几乎漏检 SeLan，而水溶性硒占总硒 72.06%，表明游离 Se-AAs 在酶解复杂环境中损失。改用“纯水超声取游离态—残渣蛋白酶 XIV 水解取蛋白结合态”两步法后，SeLan 由 5.06 升至 143.74 μg Se g^?1（主要在水提液），C. hupingshanensis 总回收由 30.19% 升至 70.97%；小麦因硒多以蛋白结合态存在，序贯法较单步无增益且水相收集略有物理损失。

3.4 酶解条件优化：水提介质用纯水优于 Tris-HCl（pH 4.5–8.5），后者使 C. hupingshanensis 水提 SeLan 由 157.30 降至 42.17 μg Se g^?1，小麦 MeSeCys 在 Tris 体系中完全检测不到、SeMet 随 pH 升高由 33.46 降至 4.09 μg Se g^?1。温度 25–50 °C 筛查显示 30 °C 为最优，小麦 SeMet 在 30 °C 达 100.38 μg Se g^?1，50 °C 锐减至 11.98 μg Se g^?1。

3.5 酶解液纯化与厌氧条件：10 kDa 超滤对 C. hupingshanensis 无显著影响，但小麦酶解液纯化后回收由 81.05% 升至 87.78%，SeMet、SeCys₂ 峰面积上升。厌氧（N₂ 手套箱）使 C. hupingshanensis 总回收由 71.57% 升至 80.65%，小麦由 80.79% 升至 90.02%；小麦 SeMet 由 98.73 升至 112.17 μg Se g^?1（增 13.61%），SAX 色谱 2.3 min 处 SeOMet/SeCys₂ 共洗脱峰面积由 8085.5 降至 2397.5，证实厌氧抑制 SeMet 氧化为 SeOMet。

3.6 与新近文献方法比对：在 C. hupingshanensis 中，本方法首次在该植物检出 γ-GluMeSeCys，确认 SeLan 为主有机硒（约占总硒 47%），与 SCX-ICP-MS 文献一致但补全 SAX 缺失形态；小麦侧仍以 SeMet 为主（66%），但 SCX 校正了 SAX 单柱对 SeCys₂ 的高估。

讨论与结论翻译浓缩：讨论指出，硒形态分析准确度受“色谱覆盖度”与“提取-稳定化流程”双重制约；SAX 单柱会低估非蛋白有机硒并可能高估 SeCys₂，而统一酶解会让超富集植物游离 Se-AAs 在酶解体系中转化丢失。研究人员强调差异提取不是可选项而是可靠营养评估前提——超富集植物须“先水提游离、后酶解蛋白结合”，非超富集植物则“纯水介质、30 °C、厌氧、蛋白酶 XIV 单步水解加超滤”即可最大化回收。结论部分原文表述为：本研究建立的成本高效正交 LC-AFS 方法可同时定量七种硒形态；壶瓶山碎米荠采用水浴超声水提+30 °C 厌氧酶解序贯法获 80.65% 回收，小麦采用 30 °C 厌氧水浴酶解单步法获 90.02% 回收；基质特异性提取是植物基硒产品营养与安全评价的基础前置条件，可支撑未来硒生物强化产业对高生物利用度有机硒的形态确证需求。