针对布法罗牛奶中隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）和十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）检测的滴 droplet 数字PCR 测定法的改进与验证

《Food Control》：Adaptation and Validation of a Droplet Digital PCR Assay for the Detection of Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis in Buffalo Milk

　　

摘要

隐孢子虫属和十二指肠贾第鞭毛虫是影响公共卫生和食品安全的主要原生动物性肠道病原体。由于缺乏标准化的分析方案以及传统诊断方法的灵敏度有限，在乳制品中检测这些病原体仍然具有挑战性。在这项研究中，我们开发并验证了一种基于液滴数字PCR（ddPCR）的检测方法，用于检测水牛奶中的隐孢子虫属和十二指肠贾第鞭毛虫。该方法表现出令人满意的检出效率（十二指肠贾第鞭毛虫为61%，隐孢子虫属为55%），以及出色的分析性能，包括1 gc/μL的检出限、100%的特异性和强日内及日间重复性。dd-PCR平台的操作独立性进一步证明了其适用于复杂乳制品中的常规检测。将经过验证的检测方法应用于从意大利南部坎帕尼亚地区两个奶牛场采集的44份水牛奶样本后，结果显示十二指肠贾第鞭毛虫的检出率为31.8%，隐孢子虫属的检出率为18.2%。5月份检测到的阳性样本数量较多，这可能表明存在季节性影响；然而，这一发现尚处于初步阶段，不能被解释为确凿的季节性模式。总体而言，研究结果表明所提出的dd-PCR检测方法是水牛奶中检测原生动物的高灵敏度和可靠工具，并强调了在高风险季节期间加强监测的必要性。

引言

隐孢子虫属和十二指肠贾第鞭毛虫是寄生于人类和动物肠道上皮的原生动物寄生虫，可引起腹泻、吸收不良和生长障碍（Wróblewska等人，2025年）。这些病原体的全球重要性已被广泛认可。全球肠病多中心研究（GEMS）的数据表明，在南亚和撒哈拉以南非洲地区，无论症状是否明显，感染都与五岁以下儿童的生长迟缓存在强烈关联（Das等人，2023年）。世界卫生组织早在1987年就认定这些原生动物是导致儿童疾病的重要因素（WHO专家委员会，1987年），而最近的FAO/WHO多标准排名再次确认了它们作为优先关注的食源性寄生虫的地位（FAO/WHO，2024年）。

反刍动物，包括水牛（Bubalus bubalis）、牛（Bos taurus）和瘤牛（Bos taurus indicus），是隐孢子虫属和十二指肠贾第鞭毛虫的重要宿主，这些寄生虫通过环境中的卵囊传播给人类（Sahin等人，2025年；Hatam-Nahavandi等人，2019年）。在水牛养殖中，成年动物感染通常表现为亚临床状态，但在新生儿和免疫功能低下的动物中可能导致严重疾病，从而因生产力下降、治疗费用增加以及群体内高感染率而造成重大经济损失（De Aquino等人，2020年）。

在意大利，水牛奶主要用于生产“Mozzarella di Bufala Campana”这种受PDO保护的奶酪，该奶酪在85–95°C的温度下加工，足以灭活大多数寄生虫（Rinaldi等人，2007年；Rutigliano等人，2025年；Fenga等人，2025年；Cacciò等人，2007年）。尽管具有这种内在的安全性，欧洲食品卫生法规（Reg. EC 852/2004；853/2004）仍要求实施经过验证的加工步骤和严格的卫生措施，以确保整个生产链的微生物安全。由于缺乏针对食品中隐孢子虫属和十二指肠贾第鞭毛虫的特定监管框架和标准化检测方法，存在低估食源性传播风险的可能性。当前的诊断方法包括显微镜检查、免疫学检测和分子技术，每种方法都有其局限性。显微镜检查具有成本效益，但需要熟练的操作人员且往往灵敏度不足（Elmahallawy等人，2023年）。免疫学检测可以实现大规模筛查，但无法区分物种或基因型（De Aquino等人，2020年）。基于PCR的基因分型、Sanger测序和探针定量PCR等分子方法通过靶向多拷贝基因组区域（如小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）和内部转录间隔区（ITS）提供更高的分析准确性（Elmahallawy等人，2023年）。SSU rRNA是多拷贝基因组区域，可提高分析灵敏度并影响定量结果。准确量化食品中的寄生虫污染情况对于风险评估、监测和制定有针对性的缓解策略至关重要（Cazeaux等人，2022年）。为了解决这些诊断需求，我们开发并验证了一种基于液滴数字RT-PCR（ddPCR）的检测方法，用于检测水牛奶中的隐孢子虫属和十二指肠贾第鞭毛虫》。此外，我们将该方法应用于坎帕尼亚地区的奶牛场，以评估这些寄生虫的季节性流行情况，为这一高价值乳制品行业的污染动态提供了新的见解。据我们所知，此前尚未有ddPCR方法被用于检测水牛奶中的隐孢子虫属和十二指肠贾第鞭毛虫》，也未应用于来自奶牛场的实际样本。本研究首次提供了符合ISO 16140标准的ddPCR方法验证结果，为水牛奶中的寄生虫检测提供了新的流行病学见解。

部分摘录

研究区域和采样

本研究在意大利南部的坎帕尼亚地区进行，该地区具有地中海温和气候，内陆和山区逐渐表现出大陆性特征。2023年8月至2024年5月期间，从萨莱诺省和卡塞塔省的两个集约化奶牛场收集了44头水牛的奶样（表1）。这些动物健康状况良好，年龄在3至9岁之间，所产牛奶的物理特性正常。每头动物抽取了50毫升的奶样。

提取性能

提取方案在所有测试样本中表现出一致且令人满意的性能。在100 gc水平下，十二指肠贾第鞭毛虫的检出率为61%，隐孢子虫属的检出率为55%，证实了该提取流程适用于水牛奶等复杂且脂肪含量高的样本。为了提供可量化的提取性能证据，我们对所有样本的DNA产量和纯度（A260/280）进行了量化，汇总数据见表3。

讨论

本研究报道了一种用于检测水牛奶中隐孢子虫属和十二指肠贾第鞭毛虫的dd-PCR方法的开发和验证，填补了食品安全监测中的一个关键诊断空白。与传统PCR和qPCR相比，ddPCR具有更高的分析灵敏度、无需校准曲线的绝对定量能力，以及对矩阵相关抑制物的更强抵抗力。这些优势特别适用于水牛奶等脂肪含量高的样本。

结论

本研究开发并验证了一种用于检测水牛奶中隐孢子虫属和十二指肠贾第鞭毛虫的dd-PCR方法。该方法表现出优异的分析性能，标志着在乳制品中检测原生动物方面的重要进展。将该方法应用于坎帕尼亚地区两个省份的水牛奶样本后，发现这两种寄生虫均存在，且5月份出现明显的季节性高峰（这一趋势应谨慎解读，因为...

作者贡献声明

Irene Dini：撰写 – 审稿与编辑，撰写原始稿件，数据整理

未引用的参考文献

D’Auria等人，2025年；Guide，2025年；ISO 16140-1，2016年；ISO 16140-2，2016年；Paraud和Chartier，2012年。

利益声明

作者声明他们没有任何已知的利益冲突或个人关系可能影响本论文的研究结果。

利益冲突声明

? 作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：Giovanna Cappelli报告称得到了意大利政府的财政支持。如果还有其他作者，他们也声明没有任何已知的利益冲突或个人关系可能影响本论文的研究结果。

致谢

本研究得到了意大利农业部（授权编号IZS ME /21 RC）的支持。