首次在欧洲无须鳕（*Merluccius merluccius*）肌肉中进行的全面过敏原特异性 qPCR 监测：跨季节与大西洋区域的时空分布

《Food Control》：First comprehensive allergen-specific qPCR monitoring in European hake ( Merluccius merluccius) muscle: Spatiotemporal distribution across seasons and Atlantic regions

　　

# 翻译

## 摘要

*Anisakis* spp.通过人畜共患感染构成双重公共卫生威胁，即使没有活的幼虫，其致敏蛋白仍会持续存在于鱼肉肌肉组织中。目前的检测方法侧重于可见幼虫，但无法评估致敏潜力，尤其是在加工食品中，耐热致敏原仍然保持活性。由于关于食用鱼肌肉中致敏原编码序列的数据有限，本研究建立了一种灵敏的qPCR检测方法，用于监测欧洲鳕鱼（*Merluccius merluccius*）背侧肌肉中四种关键致敏原（Ani s 1、Ani s 4、Ani s 7和Ani s 13）的季节性和地域性变化。2023-2024年间，从比斯开湾（BB）和爱尔兰东南部（SI）共采集了160个样本，覆盖四个季节。多重qPCR检测表现出高效性（98.8-105.5%，R2 > 0.995），检测限（LOD）为24-120 pg/μL。两种区域的四个季节中均检测到所有四种致敏原转录本，检出率因致敏蛋白、季节和地点不同而有所变化，范围为15-80%。冬季样本在两个区域中的致敏原转录本浓度均显著更高（p < 0.01）。Ani s 4表现出最高水平（0.05-244.12 mg/kg），具有显著时空交互作用（p = 0.004）：BB冬季为49.13 ± 74.98 mg/kg，而夏季为5.26 ± 5.98 mg/kg。Ani s 1在SI达到最高浓度（15.33 mg/kg；p = 0.021区域差异）。Ani s 13表现出显著的时空变化（p = 0.004），BB秋季达到峰值（7.81 ± 9.14 mg/kg），SI冬季达到峰值（7.20 ± 9.04 mg/kg）。致敏原转录本水平与寄生虫负荷之间未观察到相关性（r < 0.35，p > 0.05），表明有额外因素影响了其在宿主肌肉中的持续存在。耐热且耐胃蛋白酶降解的致敏原转录本在高浓度下持续且广泛存在，对消费者构成重大风险。这些发现揭示了致敏原分布的复杂时空模式，对风险评估具有重要意义，并支持将qPCR用作改善与*Anisakis*暴露相关的致敏原监测和食品标签政策的工具。

## 引言

与鱼类食用相关的过敏反应可由鱼类携带的危害因素引起，例如*Anisakis* spp.——一种构成严重公共卫生风险的人畜共患寄生虫（Audicana & Kennedy, 2008; Lopata & Lehrer, 2009）。尽管*Anisakis*致敏原据称不与鱼类致敏原发生交叉反应，但对这种寄生虫的过敏反应常被误诊为鱼类过敏（Kasuya et al., 1990; Lopata & Lehrer, 2009; N. Nieuwenhuizen et al., 2006）。

*Anisakis* spp.是一种在鱼类中发现的线虫寄生虫，已被世界卫生组织（WHO）、联合国粮农组织（FAO）和欧洲食品安全局（EFSA）列为重大公共卫生关注事项（FAO/WHO, 2014; EFSA BIOHAZ Panel, 2024）。这是由于其在全球范围内的发病率和分布增加、出现在消费量最高的鱼类物种中，以及其人畜共患能力（Bao et al., 2019; D'amico et al., 2014; EFSA-BIOHAZ, 2010; F?ste et al., 2014）。在此背景下，欧洲鳕鱼（*Merluccius merluccius*, Linnaeus, 1758）是一种在欧洲市场具有重要商业价值的鱼类物种（Santos et al., 2022），地理分布广泛（Casey & Pereiro, 1995; Murua, 2010; Pascual et al., 2018），其*Anisakis*感染率为67.8%（Rahmati et al., 2020）。与许多鱼类物种不同，据报道*Anisakis*幼虫会迁移到*M. merluccius*的肌肉组织中，密度可达每克0.05条幼虫（Santos et al., 2022）。这对于致敏原研究尤为重要，因为鱼片是主要的人类食用部分，也是致敏原暴露的主要途径。

意外摄入*Anisakis*第三幼虫阶段（L3，即对人类具有感染性的阶段）——通过食用生的或半生的污染海产品——会引发*Anisakis*病，症状从严重的胃肠道反应到过敏反应，甚至可能致命的过敏性休克反应（Bao et al., 2019; EFSA-BIOHAZ, 2010; F?ste et al., 2014）。EFSA的BIOHAZ小组已确定*Anisakis*是海鲜中唯一被识别为可能引发过敏反应甚至致敏症状的寄生虫，即使在食品中发现死亡或残留量也是如此（EFSA-BIOHAZ, 2010）。

迄今为止，世界卫生组织/国际免疫学会联盟致敏原命名学小组委员会（WHO/IUIS）已确认了14种与*Anisakis simplex*相关的致敏原（D'Amelio et al., 2020; WHO/IUIS, n.d.）。然而，*Anisakis* spp.致敏原的确切数量仍未知，这凸显了表征其致敏蛋白以提高诊断准确性的必要性（Arcos et al., 2014; D'Amelio et al., 2020）。在已确认的致敏原中，Ani s 1、Ani s 2、Ani s 7、Ani s 13和Ani s 14被归类为主要*Anisakis*致敏原（Anadón et al., 2009; D'Amelio et al., 2020; Mehrdana & Buchmann, 2017; Shimakura et al., 2004）。此外，几种*Anisakis*致敏原——如Ani s 1、Ani s 4、Ani s 5、Ani s 8、Ani s 9、Ani s 10、Ani s 11.0201——表现出热稳定性和耐胃蛋白酶降解特性，表明其致敏性质在烹饪或接触消化酶后仍然持续（Audicana & Kennedy, 2008; Du et al., 2021; F?ste et al., 2014; Mehrdana & Buchmann, 2017）。

对*Anisakis*致敏的过敏性患病率表现出地域差异，与饮食习惯密切相关（Rahmati et al., 2020）。挪威（18.45-22.50%）、葡萄牙（18.45-22.50%）、西班牙（14.74-18.44%）、瑞典（8.78-14.73%）和日本（8.78-14.73%）的*Anisakis* spp.过敏率较高，这些国家有食用生鱼、半生鱼或腌制鱼类菜肴的悠久传统（Rahmati et al., 2020）。尽管有这些观察结果，关于*Anisakis* spp.致敏原季节性变化的数据仍然有限。评估*Anisakis*致敏原的地域性和季节性模式对于理解暴露模式和消费者健康的潜在风险至关重要。为此，*M. merluccius*的迁徙行为和摄食生态学——随猎物可用性（特别是马鲛鱼、凤尾鱼和蓝线鳕）的季节性变化而变化——为研究*Anisakis*致敏原的时间变化提供了极好的模型（Debenedetti et al., 2019; Sousa et al., 2007; Tantanasi et al., 2012）。

食品安全机构目前执行的*Anisakis*检测实践涉及非破坏性和破坏性技术（EFSA BIOHAZ Panel et al., 2024; Godínez-González et al., 2017）。这些方法基于目视检查、光照透射和压缩方法（如UV-press）以及消化方法（Bao et al., 2019; EFSA BIOHAZ Panel et al., 2024; Gómez-Morales et al., 2018; Pozio, 2013）。然而，这些方法受限于精确度和有效性低，不适合检测加工食品中的寄生虫（Godínez-González et al., 2017; Herrero et al., 2011; Mossali et al., 2010）。此外，加工后*Anisakis*致敏原可能仍然残留，构成额外风险（Audicana & Kennedy, 2008; Du et al., 2021; F?ste et al., 2014; Mehrdana & Buchmann, 2017）。这凸显了开发和采用专门针对食品中*Anisakis*相关致敏原的有效方法的必要性，以确保充分的消费者保护（Godínez-González et al., 2021; Mossali et al., 2010; Poms et al., 2004）。挑战在于致敏原可能以低浓度存在于食品中，且食品基质的复杂性阻碍了其检测（Poms et al., 2004）。欧盟法规（EC）第853/2004号要求目视检查，但分子方法可以检测不可见的致敏原污染。在此背景下，定量实时PCR（qPCR）代表了一种强大的致敏原检测和定量的方法，由于其高灵敏度、特异性和定量能力（Godínez-González et al., 2017; Prado et al., 2016; Sena-Torralba et al., 2020; Senyuva et al., 2019）。这些特性使其适用于监测低水平污染，使其成为执行安全指南、保护消费者和协助制造商管理污染风险的重要工具（Lopez & Pardo, 2010）。

鉴于*M. merluccius*肌肉中*Anisakis*致敏原水平的数据有限，本研究旨在建立和验证一种灵敏的qPCR检测方法，用于监测四种关键*Anisakis*致敏原（Ani s 1、Ani s 4、Ani s 7和Ani s 13）在鱼背侧肌肉中的季节性和地域性变化。这种方法为评估与消费者和公共卫生最相关的鱼类肌肉中的致敏风险提供了一种灵敏、可重复且可扩展的方法。通过表征大西洋两个区域——比斯开湾（BB）和爱尔兰东南部（SI）——主要致敏原的时空分布，本研究将解决*Anisakis*致敏原暴露方面的海产品安全关键知识空白，并为欧洲渔业层面的循证决策提供支持。

## 材料与方法（节选）

### 样本采集和RNA提取

在欧洲具有经济价值的鱼类物种——欧洲鳕鱼（*M. merluccius*，平均体重1.2 ± 0.2 kg）的样本，在为期一年的时间内（春、夏、秋、冬四个季节）从两个FAO渔区采集，即比斯开湾（BB）（FAO区域27东北大西洋——第八亚区）和爱尔兰东南部（SI）（FAO区域27西北大西洋——第七亚区）。鱼类被运送到实验室，在捕获后约48小时解剖背侧肌肉，并立即储存在-80℃。

### 用于*Anisakis*致敏原检测的qPCR扩增效率、特异性和检测限（LOD）

针对*M. merluccius*肌肉组织中*Anisakis*致敏原转录本Ani s 1、Ani s 4、Ani s 7和Ani s 13的检测，优化了qPCR扩增条件。所有反应均表现出良好的决定系数，R2值为0.995至0.999（Ani s 1: 0.998; Ani s 4: 0.999; Ani s 7: 0.996; Ani s 13: 0.995）（图1）。此外，qPCR效率范围为98.8%至105.5%（Ani s 1 - 100.0%，斜率-3.3; Ani s 4 - 98.8%，斜率-3.4; Ani s 7 - 105.2%，斜率-3.2）。

## 讨论

准确的食品中致敏原定量和检测方法对于保护消费者至关重要（Poms et al., 2004）。本研究提出了qPCR应用于检测大西洋渔区（比斯开湾和爱尔兰东南部）*M. merluccius*背侧肌肉中多种*Anisakis*致敏原转录本（Ani s 1、Ani s 4、Ani s 7和Ani s 13）的新方法。qPCR技术用于检测食品样本中线虫*Anisakis*的应用效率已得到证实。

## 结论

开发用于检测面向人类消费鱼类中*Anisakis*相关致敏原的高灵敏度和快速检测方法，对于确保消费者安全健康的海产品至关重要。在本研究中，成功建立了一种稳健且灵敏的qPCR方法，用于监测*M. merluccius*肌肉组织中四种关键*Anisakis*致敏原（Ani s 1、Ani s 4、Ani s 7和Ani s 13）。检测方法显示出高效性（98.8-105.5%）、可重复性、特异性和灵敏度。

## CRediT作者贡献声明

Carla Sousa：写作——审稿与编辑、写作——初稿、软件、资源、方法学、调查、正式分析、数据整理。

Andreia Filipa-Silva：写作——审稿与编辑、写作——初稿、验证、软件、资源、方法学、调查、正式分析、数据整理、概念化。

Sónia Gomes：写作——审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源、项目管理、方法学、调查、经费获取。

## 未引用参考文献

EFSA et al., 2024; WHO/IUIS, n.d.

## 竞争利益声明

作者声明他们不存在已知的可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。

## 利益冲突声明

? 作者声明他们不存在已知的可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。

## 致谢

本研究由创新契约，项目编号C644915664-00000026 WP7-FISH，即"蓝色生物经济契约"，由FCT在葡萄牙2020计划框架下资助CIIMAR（UIDB/Multi/04423/2021和UIDB/Multi/04423/2022），并通过授予Carla Sousa的资助（https://doi.org/10.54499/2023.00570.BDANA）提供资金。

C. Sousa|A. Filipa-Silva|R. Barracosa|A.R. Ribeiro|L.M.P. Valente|M.J. Santos|S. Gomes

CIIMAR/CIMAR LA, 跨学科海洋与环境研究中心，波尔图大学，Leix?es港邮轮码头，4450-208 Matosinhos, 葡萄牙