加州植物园表土中三种共存假单胞菌分离株的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequences of three co-occurring Pseudomonas isolates from California Botanic Garden topsoil

　　

摘要

我们报告了从加州植物园表层土壤中分离得到的三株假单胞菌的完整基因组序列。其中两株分离株的平均核苷酸一致性约为99.4%，可用于研究种内微变异；第三株代表一个共存的不同物种，共同涵盖了自然土壤群落中的种和株水平基因组多样性。

公告

近缘环境分离株的高保真完整基因组，例如 abundance and diverse 假单胞菌属的分离株（1），为在完整基因组分辨率下研究微多样性提供了宝贵的资源。在此，我们报告了从加州植物园（克莱蒙，加利福尼亚州）土壤样品中分离得到的三株假单胞菌的完整基因组序列。

使用T型手柄土壤采样探针工具（Lichtund）采集土壤样品；收集点详情见表1。将土壤储存在Ziploc袋中，运送至科克研究生院，并在4°C下储存直至进一步处理。细菌富集培养方法为：将5克土壤加入25毫升假单胞菌最小培养基（含2 mM MgSO₄、0.31 mM FeCl₃、0.03 mM CaCl₂、15 mM NaH₂PO₄和15 mM K₂HPO₄，pH调至6.8）中，并分别加入五滴Na-琥珀酸盐（10%溶液）和NH₄Cl（20%溶液）作为碳源和氮源（2）。富集培养2天后，使用1 μL接种环将富集液划线接种至假单胞菌最小琼脂培养基（1.5%琼脂）上。培养2天后，挑取菌落并接种至假单胞菌分离琼脂培养基（PIA；货号：C6681；500毫升超纯水，12.5克PIA基础培养基，10毫升甘油）上。挑取单菌落并在L型肉汤培养基（LB；25克/升，2.5% w/v）中过夜培养。次日上午，选取光密度（OD600）大于0.6的培养物进行保藏。取选定的培养物650 μL，与50%甘油溶液按1:1比例混合，制备好的样品在-80°C下作为菌种库储存。在此过程中获得了多个细菌分离株；然而，本研究特别聚焦于三株选定的假单胞菌分离株，并报告其完整基因组序列。

表1

表1 三株假单胞菌分离株的基因组组装、注释和收集元数据^a

特征	分离株 8-5-2	分离株 9-2-1	分离株 8-10-2
测序样本ID	B9TF7H_1_Sample_1_8A	XH254M_1_sample_1	CZJZZ4_1_rerun_Sample_2_8B_2
登录号	JCAFHX000000000	JCAFHY000000000	JCAFHW000000000.1
原始读段登录号（SRA）	SRR39379362	SRR39379361	SRR39379360
分离来源	加州植物园土壤	加州植物园土壤	加州植物园土壤
坐标	34°6′54″ N, 117°43′28″ W	34°6′54″ N, 117°43′28″ W	34°6'54″ N, 117°43'28″ W
海拔（米）	410	410	410
相邻植物	Chilopsis linearis（柳叶树）	Aesculus californica（加州马栗）	Chilopsis linearis（柳叶树）
测序平台	Oxford Nanopore（长读段）	Oxford Nanopore（长读段）	Oxford Nanopore（长读段）
基因组大小（bp）	5,929,752	6,178,779	5,698,233
重叠群数（n）	1	1	1
拓扑结构	环状	环状	环状
N50（bp）	5,929,752	6,178,779	5,698,233
GC含量（%）	62.6	62.4	62.6
测序深度（×）	95	94	96
总读段数	559,553	354,501	546,337
读段N50（bp）	8,803	9,050	9,663
读段中位长度（bp）	3,474	3,436	3,839
读段中位质量（Phred）	24.52	25.79	23.48
完整度 %（CheckM）	99.74	99.74	100.00
污染率 %（CheckM）	0.87	1.94	0.20
最接近物种（GTDB）	Pseudomonas_E sp013179515	Pseudomonas_E sp013179515	Pseudomonas_E capeferrum
与最接近物种的ANI（%）	99.75	99.53	98.66
总基因数	5,410	5,588	5,199
CDS（蛋白编码基因）	5,264	5,449	5,055
tRNA	73	74	79
rRNA	22	22	22
ncRNA	50	42	42
假基因	10	11	12
假设蛋白	177	233	172
编码密度（%）	89.7	89.6	90.9

^a

分离株为列，指标为行。坐标采用度-分-秒格式（WGS84）；海拔单位为米。完整度和污染率由CheckM评估；最接近物种和ANI由sourmash（GTDB）获得。

对于基因组测序，将保藏菌种在LB琼脂培养基（1%琼脂）上复苏培养，随后在10毫升LB培养基（2.5% LB）中培养。过夜培养物在3,000 g下离心15分钟收集，并用PBS洗涤两次。按照制造商说明使用QuickDNA试剂盒（Zymo Research Corporation）提取DNA。使用Portlite荧光DNA定量试剂盒（AAT Bioquest）进行DNA定量，并重新标准化至50 ng/μL。取20微升至Plasmidsaurus（俄勒冈州尤金市）进行Nanopore测序，使用ONT连接测序试剂盒v14（SQK0LSK1114）文库制备，不进行DNA剪切和大小选择，在R10.4.1 flow cell上进行。

除非另有说明，本研究中使用的所有软件均使用默认参数。碱基识别由Dorado执行，采用超高精度（sup）碱基识别模型（v4.3.0 [3]）。读段质量过滤使用Filtlong（v0.2.1 [4]），参数为"--min_length 300—keep_percent 95"。从头组装由Autocycler（v0.2.1 [5]）生成，输入组装来自Flye（v2.9.6 [6]）、hifiasm（7）ONT模式和Plassembler（v1.8.0 [8]）。环状组装图使用dnaapler（v1.2.0 [9]）重新定向。基因组完整度和污染率由CheckM（v1.2.2 [10]）评估。分离株通过sourmash（v4.9.4 [11]）对照GTDB数据库进行分类学分类，所有分离株均被归入假单胞菌属，其中两株与Pseudomonas sp013179515（GCF_013179515.1）的平均核苷酸一致性（ANI）为99.5%-99.75%，一株与Pseudomonas capeferrum（GCF_000731675.1，ANI 98.66%）分类相同。基因组由Bakta（v1.12.0 [12]）进行注释。原始测序数据和一般基因组特征总结于表1。

致谢

研究团队感谢加州植物园在促进采样方面提供的帮助，以及科克研究生院在基础设施和财务方面提供的支持。