柠檬黄片球菌DMLC16中与aac(6′)-I相关的卡那霉素抗性的功能基因组学研究

《Food Microbiology》：Functional genomic insights into aac(6′)-I-associated kanamycin resistance in Leuconostoc citreum DMLC16

　　

摘要

柠檬片球菌（L.）柠檬片球菌 DMLC16 菌株最初被选为发酵食品的候选发酵剂。然而，该菌株对卡那霉素的最低抑菌浓度（MIC）为 256 mg/L，超过了欧洲食品安全局（EFSA）的抗性阈值。为确定该抗性是固有特性还是获得性特性，本研究对该菌株与另外四个柠檬片球菌菌株进行了比较基因组分析。结果发现，仅有 DMLC16 携带氨基糖苷 6′-N-乙酰转移酶（aac(6′)-I）基因。此外，还鉴定到一个相邻的 IS30 家族转座酶及一个推定的识别序列（5′-TGTTGAGTACAGGTTG-3′），且其周围染色体区域含有通常与质粒相关的复制起始蛋白，这些证据强烈提示 aac(6′)-I 代表一种获得性性状。功能验证进一步确认了该基因在抗性中的作用：将 aac(6′)-I 克隆至革兰氏阳性宿主中可使其卡那霉素 MIC 升高，在金黄色葡萄球菌 RN4220 中从 4 mg/L 升至 64 mg/L，在乳乳球菌 乳乳球菌 MG1363 中从 2 mg/L 升至 32 mg/L。这些发现表明，柠檬片球菌 DMLC16 携带一个赋予卡那霉素抗性的获得性遗传决定因素。相比之下，种水平比较基因组分析提示，16S rRNA 基因和 gidB 中的保守序列变异可能共同贡献于 柠檬片球菌 固有的卡那霉素抗性表型。这些观察结果表明，有必要进行菌株水平的基因组筛查以识别获得性抗性决定因素，同时还需进一步研究该物种全体的卡那霉素敏感模式以及固有抗性的遗传基础。重要的是，携带 aac(6′)-I 的 柠檬片球菌 菌株不应被视为合适的工业发酵剂候选菌株。

引言

确保食品发酵所用微生物的安全性是基本前提。根据国际指南，益生菌和发酵剂候选菌株必须具备安全食用的历史记录，且无致病性记录（EFSA, 2004; EFSA, 2025; FAO/WHO, 2002）。虽然此类评估通常在种水平进行，但菌株水平的评估对于排除获得性抗生素抗性基因和毒力因子的存在仍然至关重要（EFSA 饲料添加剂及产品或动物饲料中使用的物质评估小组, 2012; Heo 等, 2022）。特别是，当同一属或种中的其他成员已知具有溶血活性或毒力性状时，建议针对这些因素进行靶向验证（EFSA, 2004; FAO/WHO, 2002）。

抗生素抗性转移的风险尤为值得关注，因为获得性抗性基因可水平转移至肠道微生物组，从而降低抗生素治疗的疗效（美国疾病控制与预防中心, 2013）。水平转移主要通过质粒、转座子和转导等移动遗传元件发生（Aviv 等, 2016; Cuecas 等, 2017; Rossi 等, 2014）。因此，欧洲食品安全局（EFSA）指南建议在评估新菌株时验证此类元件的缺失（EFSA 饲料添加剂及产品或动物饲料中使用的物质评估小组, 2012）。抗性通常首先进行表型评估，若观察到抗性，则需进一步进行基因组分析以区分质粒或转座子介导的性状与固有染色体抗性（EFSA 饲料添加剂及产品或动物饲料中使用的物质评估小组, 2012; Jeong 等, 2017; Lee 和 Jeong, 2015; Lee 等, 2019; Martens 等, 2020）。由于在实践中很难做出这一区分，食品行业倾向于避免使用表现出表型抗性的菌株（Jeong 等, 2014; Maiden, 1998; Na 等, 2025）。

当前的评估依赖于 EFSA 提出的抗生素特异性截止值（EFSA 饲料添加剂及产品或动物饲料中使用的物质评估小组, 2012）。然而，某些属，包括双歧杆菌属、片球菌属和片球菌属，仅在属水平进行了评估。值得注意的是，多个片球菌属菌株的卡那霉素和链霉素数值超过 EFSA 截止值（Casado- Mu?oz 等, 2014; Jeong 和 Lee, 2015; Flórez 等, 2016; Lee 等, 2024; Lee 等, 2025b），这表明需要修订阈值并进行更深入的机制研究，尤其是针对卡那霉素抗性。

我们近期研究了加入海鲜配料制作的白菜泡菜（baechu-kimchi）中的微生物群落变化，发现柠檬片球菌（L.）柠檬片球菌 是第四丰富度最高的物种（Park 等, 2023, 2024）。该物种自 2007 年起被列入 EFSA 合格安全推定名单（EFSA, 2007），并被国际乳制品联合会认定为适用于乳制品、海鲜、烘焙食品、植物基产品和酒精发酵的发酵剂（Bourdichon 等, 2022）。因此，该物种被认为是有食用历史的安全物种。为评估柠檬片球菌作为新发酵剂候选菌株的可行性，本研究对其抗生素抗性和溶血活性进行了评价（Lee 等, 2024）。所有受测菌株的卡那霉素数值均超过 EFSA 截止值（Lee 等, 2024）。这一发现提示，柠檬片球菌的卡那霉素抗性可能代表一种物种特异性的固有性状，而非获得的、可水平转移的抗性决定因素。如果卡那霉素抗性是固有的，通常认为其水平基因转移风险较低，不应妨碍柠檬片球菌菌株作为食品发酵剂的选用。为进一步评估这一可能性，我们此前对候选发酵剂菌株柠檬片球菌 DMLC16 进行了全基因组分析，以识别与卡那霉素抗性相关的遗传决定因素（Lee 等, 2025a, Lee 等, 2025b）。然而，未检测到已知的获得性卡那霉素抗性基因。这些发现提示，柠檬片球菌的卡那霉素抗性表型不能仅用获得性抗性机制来解释，可能还涉及固有遗传决定因素。因此，我们假设与卡那霉素敏感性相关的基因序列变异或先前未被识别的抗性决定因素可能共同贡献于所观察到的表型。据此，本研究进行了比较基因组分析，以识别柠檬片球菌 DMLC16 中卡那霉素抗性背后的遗传基础。

章节摘要

细菌菌株与培养条件

此前研究中所分离并表征的柠檬片球菌 DMLC16 菌株（Lee 等, 2024, 2025a）进行了基因组分析。该菌株对卡那霉素表现出抗性。为验证基因组分析结果的实验证明，本研究使用了 CBA3623、EFEL 2700、PL105 和 KACC 11860^T（=NRIC1776 ^T）菌株（Kim 等, 2018; Takahashi 等, 1992）（表 1）。柠檬片球菌 CBA3623、EFEL 2700 和 PL105 由忠北大学泡菜世界研究中心惠赠。

柠檬片球菌的比较基因组分析

为识别可能参与柠檬片球菌卡那霉素抗性的基因，本研究利用 NCBI 数据库中截至 2025 年 3 月可获得的十个柠檬片球菌完整基因组进行了比较基因组分析（附表 S1）。其中，三个菌株——CBA3623、EFEL 2700 和 PL105——被获取用于表型比较（表 1）（Kim 等, 2018; Takahashi 等, 1992）。此外，还纳入了可获得草图基因组的模式菌株柠檬片球菌 KACC 11860^T。

MIC 值

CRediT 作者贡献声明

Sumin Lee：论文初稿撰写、方法学、调查研究、形式化分析、数据管理。Sojeong Heo：论文审阅与编辑、验证、形式化分析。Yura Moon：验证、形式化分析。Minkyeong Kim：方法学、调查研究。Do-Won Jeong：论文审阅与编辑、论文初稿撰写、验证、监督指导、资源提供、项目管理、方法学、调查研究、资金获取、概念构思。

基金信息

本研究由国家研究基金会（NRF）资助 [NRF-RS-2024-00334769]。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

Sumin Lee | Sojeong Heo | Yura Moon | Minkyeong Kim | Do-Won Jeong

淑明女子大学 食品营养系，首尔，02748，大韩民国