基于Illumina与Oxford Nanopore宏条形码测序技术对亚南极地区土壤真菌沿海拔梯度的群落特征分析

《Fungal Ecology》：Metabarcoding with Illumina and Oxford Nanopore for the characterization of subantarctic soil fungi along an altitudinal gradient

　　

摘要

高纬度生态系统正经历快速的环境变化，然而亚南极地区的真菌多样性仍缺乏充分描述。纳瓦里诺岛（55°S）是一个具有全球意义却研究不足的景观区域，对于描述真菌群落具有重要价值。本研究利用ITS标签扩增子测序技术，沿海拔梯度表征了土壤真菌群落。测序工作采用了Illumina和牛津纳米孔（ONT）两种技术，以评估它们在真菌群落表征中的互补性。生物信息学处理使用LotuS2流程完成，并对ONT长读长进行了流程调整。对两种技术的群落组成、α多样性及β多样性模式以及功能类群组成进行了评估。Illumina共恢复2858个OTU，而ONT根据处理方法不同，恢复的数量在353至1179个之间。Illumina在分类学分辨率和组成差异检测方面表现更优，而ONT的输出结果受分析流程影响较大。尽管存在方法学差异，两种技术均检测到了一致性的生态模式：外生菌根真菌的丰度随海拔升高而增加，与既往研究描述一致；同时在所有真菌功能类群中也恢复了共享的类群。此外，ONT还检测到一些独特类群，表明其在真菌群落表征方面具有互补潜力。本研究为理解亚南极生态区域的土壤真菌多样性提供了基线数据，并为未来监测生物多样性对气候变化的响应提供了重要数据支持。

引言

真菌界是地球上多样性最高的真核生物类群之一，从单细胞生物到复杂的丝状菌体均有涵盖（Naranjo-Ortiz和Gabaldón, 2019），估计物种数量从150万到超过600万不等（Blackwell, 2011; Hawksworth和Lücking, 2017），但围绕这些计算的方法学存在重要不确定性（Peay等, 2016; Hyde等, 2024）。此外，近期研究表明真菌多样性集中在高纬度地区（Větrovsky等, 2019），这与此前针对植物及其他类群所描述的模式恰好相反。真菌栖息于几乎所有环境中，包括极端环境（Dighton和White, 2017）。真菌、细菌和无脊椎动物是土壤生态系统的主要组成成分，其中前两者可占生物量的95%，并驱动有机质循环和养分利用（Condron等, 2010）。真菌的代谢复杂性支撑着有机化合物的循环，它们与植物形成共生关系，增强养分的吸收和水分获取（Allison和Martiny, 2008; Sylvia等, 2005）。这些相互作用也使真菌成为土壤健康的关键指示生物（Hill等, 2000）。然而，这些重要功能正受到人为干扰的威胁，破坏了其生态和生理功能（McGuire等, 2010; Jansson和Hofmockel, 2018）。最新证据表明，不同类型的干扰对土壤真菌的组成和功能方面可能产生不同影响（Zhou等, 2020, Rodriguez-Ramos等, 2021）。在此意义上，原始且受干扰最少的森林可作为天然实验室，用于评估生物多样性模式和检验生态学假说（Heilmann-Clausen等, 2016）。

亚南极生态区域是地球上保存最完好且气候最脆弱的地区之一，拥有全球最南端的森林生态系统（Rozzi等, 2006; Aguirre等, 2021）。在这些生态系统中，剧烈的环境梯度在较短的海拔距离内发生，造成植被类型和微气候条件之间的高度压缩过渡。具体而言，0°C等温线通常位于海拔1000米以下，使得从混合常绿林到高安第斯苔原的完整过渡仅在几百米海拔差异内即可实现（Aguirre等, 2021）。沿此梯度已描述了四个主要植被群落：低海拔以Nothofagus betuloides和N. pumilio为主的混合林，中海拔纯N. pumilio林，近树线附近的矮曲木灌丛，以及高海拔以Bolax gummifera等垫状植物为主的高安第斯苔原（Pisano, 1977, 1980, 1981; Luebert和Pliscoff, 2006; Molina等, 2016）。

植被结构的急剧过渡及其伴随的气候变量和土壤条件变化，预期将作为环境过滤器塑造真菌群落的组成和功能类群分布。海拔梯度已被反复证明会影响真菌丰富度、周转率和生态特化程度（Geml, 2017; Shen等, 2020; Zhang等, 2024; Richter等, 2024），在寒冷温带和亚南极生态系统中尤为如此（Deslippe等, 2012; Geml等, 2014; Tedersoo等, 2014）。在以南青冈属（Nothofagus）为主的森林生态系统中，外生菌根真菌已知在相对丰度上向高海拔和树线附近环境增加，它们在这些环境中对养分获取和植物耐受恶劣环境条件发挥关键作用（Marín等, 2018; Truong等, 2019; Saona等, 2025）。相反，腐生菌和病原菌在低海拔森林中可能更为丰富，这些地区气温更高且人为扰动更大（Siles和Margesin, 2016; Delgado-Baquerizo等, 2020）。牛肝菌科（Cortinariaceae）等类群在巴塔哥尼亚森林中尤为多样，可能在树线附近的外生菌根群落中占主导地位，尤其是在较冷的季节（Truong等, 2019; Saona等, 2025）。

亚南极高安第斯生态系统也是植被类型中最易受气候变化影响的一类，因为气温升高预计将促进Nothofagus pumilio森林向上扩张，逐步减少高山苔原群落所占的面积（Aguirre等, 2021）。因此，理解这些环境梯度上真菌群落的组成至关重要，因为由气候变化驱动的真菌功能类群转变可能会强烈影响这些极端环境中的养分循环、土壤碳动态和生态系统稳定性（Marín和Kohout, 2021; Geml等, 2022）。

传统方法（如标本调查和培养方法）在表征土壤真菌群落方面面临挑战，因为它们往往无法检测到土壤中大部分存在的真菌多样性（Amann等, 1995; Miller, 1995; Van der Linde等, 2012）。分子技术的发展使得获取更详细的土壤真菌多样性数据成为可能，并进一步理解其群落动态（Fierer, 2017; Saine等, 2020），同时避免了因遗漏不可培养物种而低估真菌多样性的风险（Anderson等, 2003b; Dickie等, 2002）。利用环境DNA（eDNA）标签扩增子（Lindahl等, 2013, Yahr等, 2016, Ruppert等, 2019; Rosa等, 2020a, 2020b）进行真菌群落表征，使用核糖体rDNA区域中的标记基因（如18S、ITS和28S）来鉴定真菌及其他真核生物（Prosser, 2002; Martin和Rygiewicz, 2005; Schoch等, 2012）。该技术已被广泛用于描述土壤真菌群落（Schmidt等, 2013; Alem等, 2022; Krah和March-Salas, 2022; Gon?alves等, 2023）。尽管取得了这些重要进展，世界上许多地区仍未得到充分研究（Van Galen等, 2025; Van Nuland等, 2025），这对其在快速全球气候变化下的保护构成了挑战。

短读长测序技术（如Illumina MiSeq或NextSeq）由于具有高通量和准确性，已成为DNA真菌标签扩增子的标准（Schmidt等, 2013），尽管其在物种鉴定方面存在读长限制。近年来，长读长测序技术（如PacBio和牛津纳米孔）崭露头角，使得对较长DNA片段（如整个ITS区域）进行测序成为可能（Tedersoo等, 2021）。尽管纳米孔技术的原始读长准确性较低，但其高度便携的优势使其能够实现现场原位测序，具有更低的初始成本和快速的工作流程（Edwards等, 2016; Gowers等, 2019; D'Andreano等, 2020; Stahl-Rommel等, 2021; Ohta等, 2023）。此外，自2015年推出以来，纳米孔的化学试剂包和碱基识别算法已有了显著改进（Han等, 2020; Zeng等, 2020; Zhang等, 2023; Bogaerts等, 2024; Dippenaar等, 2024），使原始读长准确率可超过99%（Balo?lu等, 2021）。目前，优化用于真菌长读长测序数据处理的合适生物信息学流程仍然缺乏（Caporaso等, 2012; Langille等, 2013; Sch?ler等, 2017; Tedersoo等, 2021），尽管最近出现了一些用于长读长标签扩增子的有前景的工具（Graetz等, 2025）。尽管迄今为止使用纳米孔长读长进行标签扩增子的研究非常少，但已展现出巨大潜力。特别是随着长读长全长标记参考数据库的开发，以及新流程的优化（Tedersoo等, 2022; Bista和Lino, 2026）。此外，Illumina和纳米孔测序在标签扩增子研究中的互补性尚未被深入探索，特别是后者如何能为探索不足且偏远的生态系统提供宝贵的真菌群落评估数据，在这些地方技术设备和基础设施的获取受到限制。

在智利，已正式描述了约3300种真菌物种（不包括地衣化真菌）（Jaksic和Mella-Flores, 2023），尽管普遍认为大部分真菌多样性仍未被记录（Aqueveque等, 2017）。历史上，巴塔哥尼亚森林的真菌多样性主要通过子实体调查和传统分类学方法加以表征（Gamundí, 1971, 1975; Wright和Deschamps, 1975; Horak, 1979; Gamundí和Horak, 1993; Gamundí等, 2004; Gamundí和Amos, 2007）。近年来，环境DNA标签扩增子研究开始揭示巴塔哥尼亚生态系统中真菌群落的多样性和生态结构，包括巴塔哥尼亚北部和南部南青冈森林中与之相关的外生菌根群落（Nouhra等, 2013; Truong等, 2019, 2024; Saona等, 2025），以及安第斯-巴塔哥尼亚森林中的木材腐朽真菌（Molina和Pildain, 2022）。然而，麦哲伦亚南极地区的土壤真菌群落仍研究不足，特别是在环境梯度方面。

这一信息缺失还因参考数据库（如UNITE和NCBI）中存在重要的地理偏差而进一步加剧，其中亚南极和南极生态系统中的真菌类群代表性严重不足（Khomich等, 2018）。因此，从这些生态系统中获得的许多环境序列可能对应于未描述的类群或代表性不足的谱系。此外，短读长标签扩增子方法可能由于双端测序组装和扩增子回收的限制，低估了某些具有较长ITS区域的重要真菌类群，如牛肝菌科（Truong等, 2019）。牛津纳米孔等长读长测序平台可能通过实现对整个ITS区域的测序，提供互补信息，并有望改善对表征不足的真菌群落的恢复。

亚南极地区的土壤真菌群落研究十分有限，尤其是其沿生态梯度的变化。因此，该岛上的真菌多样性目前很可能被严重低估。为填补这一知识空白，本研究采用牛津纳米孔和Illumina MiSeq的eDNA ITS标签扩增子技术，对纳瓦里诺岛（Isla Navarino）的土壤真菌群落进行了表征，覆盖了合恩角生物圈保护区的主要植被过渡带。基于此前寒冷温带和南青冈森林的研究，我们假设真菌群落组成将随海拔梯度发生变化，这是由于植被结构和气候条件的变化所导致的环境过滤效应。我们进一步预期外生菌根真菌向高海拔增加，这符合Nothofagus pumilio向树线方向占主导的趋势。最后，我们预测Illumina测序将提供更高的丰富度值和更好的分类学分辨率，而纳米孔测序将在捕捉可比拟的大尺度生态模式的同时，通过全长ITS测序提供互补信息。

研究区域

本研究在Cerro Bandera进行（具体采样点坐标见表S1），位于麦哲伦亚南极生态区域Puerto Williams附近，处于合恩角生物圈保护区内（图1A）。该地区具有全球最极端的经度降雨梯度之一（Quilodrán等, 2022）和陡峭的海拔梯度（海拔0至600米），塑造了沿坡面的植被分布（Contador等, 2015）。沿梯度的主要生态系统包括……

测序数据概述

Illumina ITS2测序共产生497万条原始序列，经LotuS2流程处理后得到366万条序列，代表3348个OTU。随后检查并移除非真菌分类单元，最终保留2858个OTU对应30个样本。稀释至每样本2000条序列的均匀深度后，数据集弃去1022个OTU，剩余1836个OTU。

两次纳米孔测序运行共产生28.85吉碱基的原始数据……

测序数据处理

Illumina稀释曲线（图S3）表明大多数采样点具有适当的采样深度。然而，两个ONT数据集（图S4和S5）在所有采样点均未达到渐近线，这可能是因为测序深度较低，也可能是因为所生成OTU的分类学分辨率较低。

考虑到ONT原始数据的体量，后者似乎更为可能，因为有证据表明某些关键数据处理步骤，如质量过滤和聚类，可能会对...产生影响

结论

本研究提供了首批结合短读长和长读长技术对南极圈附近地区土壤真菌群落进行元条形码评估的研究之一，为理解真菌多样性在不同区域生态梯度上的分布模式奠定了基础。尽管在测序深度、分类学分辨率和数据处理性能方面存在差异，Illumina和Oxford Nanopore两种平台均检测到许多相同的物种，涵盖了大多数真菌功能类群，并表现出相似的生态...

数据可用性

用于序列处理和下游生态分析的所有脚本和参数均公开在GitHub仓库中（https://github.com/SebaZambrano/Navarino_fungi_metabarcoding）。两种技术的原始去多路复用fastq文件已存储于NCBI序列读取档案馆（SRA）中，登录号为PRJNA1480825。

作者贡献声明

Sebastián Zambrano-Rojas：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿撰写、可视化、方法论、调查研究、形式化分析、概念化。Laura Sánchez-Jardón：撰写——审阅与编辑、概念化、数据整理、调查研究、方法论、监督、验证。Roberto Uribe-Paredes：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源、项目管理、调查研究、资金获取。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

我们感谢地下网络保护协会（SPUN）（https://www.spun.earth/）为样本提供Illumina测序服务，特别感谢Bethan Manley完成了原始数据的生物信息学处理，并为本文手稿提供了宝贵意见。感谢来自维多利亚皇家植物园（澳大利亚）的Camille Truong为本研究的开展和手稿撰写提供了宝贵意见。感谢南大洋技术...

Sebastián Zambrano-Rojas | Laura Sánchez-Jardón | Roberto Uribe-Paredes