《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Systematic discovery of circular permutations across the protein universe using CIRPIN
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蛋白质结构搜索已被深度学习技术彻底改变，这些方法能够快速搜索庞大的数据库。然而，当前的结构搜索工具常常遗漏由拓扑重排（尤其是环状排列，circular permutation）相关的蛋白质，即蛋白质共享高度相似的结构，但其末端定位不同。研究人员引入了一种环状排
蛋白质结构搜索已被深度学习技术彻底改变，这些方法能够快速搜索庞大的数据库。然而，当前的结构搜索工具常常遗漏由拓扑重排（尤其是环状排列，circular permutation）相关的蛋白质，即蛋白质共享高度相似的结构，但其末端定位不同。研究人员引入了一种环状排列不变图神经网络（CIRPIN），通过使用合成环状排列（synthetic circular permutations）的数据增强策略解决了这一局限性。研究表明，CIRPIN能够学习对环状排列不变的蛋白质表示，从而能够在蛋白质结构分类数据库（SCOP）和AlphaFold簇代表数据库（AlphaFold Cluster Representatives）中识别结构相似的蛋白质。利用CIRPIN，研究人员创建了CIRPIN-DB，一个包含1830万个蛋白质对的数据库，高度富集环状排列关系。该数据库包含来自CATH蛋白质结构分类数据库中845种独特拓扑的结构，代表了迄今为止组装的最全面、规模最大的环状排列相关蛋白质资源。值得注意的是，在多个新型环状排列变体中，研究人员发现PDZ结构域——多结构域蛋白中最常插入的结构域——存在四种不同的环状排列形式。研究结果确立了CIRPIN作为研究环状排列蛋白质进化机制的强大工具。
**论文解读：基于CIRPIN的蛋白质环状排列系统发现**
**研究背景与问题**
蛋白质结构预测工具（如AlphaFold）已为超过两亿个蛋白质预测了结构，极大推动了生物学研究。为发掘新折叠、识别同源蛋白并探索蛋白质结构多样性，研究者开发了Foldseek、TM-Vec等结构搜索工具。然而，这些工具高度依赖顺序比对（sequential alignment），难以识别经历拓扑重排的蛋白质，尤其是环状排列——即蛋白质整体三维结构相似，但N端和C端位置发生互换或重定位的现象。环状排列在蛋白质工程和进化研究中具有重要价值，例如设计变构开关、纳米颗粒和蛋白酶感应Cas9。然而，已知的环状排列案例多为针对单个蛋白的偶然发现，缺乏系统性搜索方法。传统比对方法（如动态规划）在大规模比较中速度过慢，而现有结构搜索工具（如Progres）由于在表示蛋白质时保留了N/C端位置信息，同样对环状排列不敏感。因此，亟需一种能够高效识别环状排列关系的方法，以系统研究其自然界的分布与进化意义。
**研究内容与结论**
研究人员开发了一种环状排列不变图神经网络CIRPIN，通过引入合成环状排列（synCP）数据增强策略，使模型学习到对环状排列不变的蛋白质表示。将CIRPIN与同样训练但不具备环状排列感知能力的Progres模型进行对比，通过两者嵌入分数的差异（ΔCP）识别环状排列候选对。利用CIRPIN，研究人员在SCOPe和AlphaFold簇代表数据库（AFDB-ClustR）中进行了大规模搜索，构建了CIRPIN-DB数据库，包含1830万个高置信度的环状排列蛋白质对，覆盖CATH数据库845种拓扑，是迄今最大的环状排列资源。该研究发现PDZ结构域存在四种不同的环状排列拓扑形式，并揭示了多个此前未表征的环状排列家族。研究还证明CIRPIN能够识别由二级结构重连（rewiring）、插入（insertion）或延伸（extension）等复杂重排所隐蔽的同源关系。该工作发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》。
**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术：基于E(n)-等变图神经网络和对比学习构建CIRPIN模型；设计合成环状排列操作（synCP）在训练中生成随机环状排列变体；利用Progres和CIRPIN双模型嵌入分数差异进行候选筛选；结合TM-align及其环状排列感知模式（-cp）进行结构验证；使用Foldseek对结构进行聚类去冗余；样本来源包括SCOPe 40%序列同一性数据集、ECOD数据库、AFDB-ClustR（约270万个代表结构）以及TED注释的3.5百万个结构域。
**研究结果**
**1. 结构比对方法对synCP的探测**：研究人员生成了所有可能的synCP，测试Progres和TM-align对环状排列的敏感性。结果显示，Progres对环状排列的分数严重依赖氨基酸顺序，同一蛋白不同synCP的分数波动剧烈；TM-align在不启用-cp参数时对许多synCP失效，而启用-cp后虽然能识别，但其速度无法满足大规模数据库搜索需求。
**2. CIRPIN基准测试**：CIRPIN在SCOPe同源蛋白检索任务中达到与Progres相当的性能（fold、superfamily、family的恢复分数分别为0.166、0.692、0.865）。在ECOD数据库的1,000个同源组中，CIRPIN在407组中恢复了Progres遗漏的同源对，Progres仅在80组中表现更优，表明CIRPIN能更好地捕获环状排列相关的远程同源关系。
**3. 人工验证的环状排列基准集**：研究人员通过文献调研构建了11对经过PyMOL目视验证的环状排列蛋白对。CIRPIN恢复了9对（调整后7/9），显著优于Progres（4/9，调整后2/9）和TM-align（3/11），接近TM-align -cp的恢复率（7/11）。
**4. SCOPe中的环状排列发现**：利用筛选流程（Progres<0.6，CIRPIN>0.9，TM-align及ΔTM分析），在SCOPe 40%数据库中发现1973对高置信环状排列关系，聚类后得到193–304个结构簇。估计SCOPe中环状排列比例为4.4%–7.0%，低于此前基于CPDB报道的9%–36%。分析发现CPDB存在明显冗余（约20%为伴刀豆球蛋白样结构）和部分假阳性，且包含工程改造环状排列变体。
**5. PDZ结构域的新型环状排列**：在SCOPe β类折叠中，b.36（PDZ结构域样）富集环状排列关系。研究发现PDZ结构域至少存在三种（随后扩展为四种）不同的环状排列拓扑变体，包括此前未表征的PDZ环状排列（如2hga结构）。通过对AFDB-ClustR中2,563个PDZ结构域的嵌入主成分分析，发现一个独立的新簇，代表第四种PDZ环状排列拓扑，进一步扩展了该结构域的拓扑多样性。
**6. AFDB-ClustR中的新型环状排列**：对约350万个结构域进行大规模搜索，经TM-align -cp过滤后得到18,301,678个环状排列候选对，涉及589,113个独特结构域，归属于845种CATH拓扑。随机抽样100对进行人工评估，预计精确率为72%。新发现的环状排列包括内肽酶、核糖核酸酶H样结构域等。值得注意的是，核糖核酸酶H样结构域与此前报道的核糖核酸酶T2样/BECR折叠结构域的TM-score仅为0.38和0.27，低于常用阈值，但CIRPIN仍能识别，凸显其对弱结构相似性的敏感度。
**7. 重连和插入导致的遮蔽关系检索**：研究人员发现部分具有高ΔCP分数但ΔTM=0的蛋白质对，其结构具有相同架构但不同的二级结构连接方式（重连），或存在插入/延伸。去除插入后，Progres分数显著提高，而CIRPIN分数几乎不变，表明CIRPIN嵌入可用于搜索更复杂重排相关的蛋白质对。
**8. 节点嵌入揭示三级基序**：对单个节点的嵌入分析显示，CIRPIN能够在蛋白内部识别具有相似局部结构的三级基序，如螺旋区之间的相似性、N端和C端β折叠之间的相似性，以及1uur蛋白中两个几乎可重叠的子结构（TM-score=0.81）之间的相似性。Progres嵌入则缺乏这些信号，说明CIRPIN通过训练synCP学习到了基于局部上下文的结构特征，而非仅依赖顺序位置。
**讨论与结论**
研究人员指出，环状排列关系不必然暗示同源进化，可能由趋同进化产生。未来工作可通过系统发育分析区分趋同与趋异。CIRPIN数据库为研究环状排列蛋白的进化机制提供了宝贵资源，同时识别了与插入、重连相关的结构相似对，弥补了现有基准测试集规模不足的问题。CIRPIN可在Google Colab和在线服务器上使用。研究者强调，当前搜索采用的保守ΔCP阈值可能遗漏细微环状排列，而数据库域解析错误也可能导致漏检。总之，CIRPIN通过半合成数据生成策略，在避免显式比对的前提下实现了超大规模环状排列搜索，为蛋白质结构比较和进化研究提供了新范式。
