抗白血病药物ponatinib减弱巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化

《Immunobiology》：The anti-leukemia drug ponatinib attenuates NLRP3 inflammasome activation in macrophages

　　

NOD样受体家族pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体是糖尿病、阿尔茨海默病和痛风等疾病中炎症的公认驱动因素。此前，研究人员筛选了875种FDA批准的药物以寻找NLRP3抑制剂，并鉴定出ponatinib是五种候选药物之一，该药物在骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中减少NLRP3炎症小体活化且不引起细胞毒性。因此，研究人员假设ponatinib可能是一种有效的NLRP3炎症小体抑制剂。研究人员进行了剂量曲线和细胞毒性测定，以确定ponatinib在BMDMs（1μM）和原代小胶质细胞（0.5μM）中减少IL-1_β分泌且不诱导细胞毒性的有效体外浓度。在BMDMs中，ponatinib抑制了Nlrp3和Caspase-1依赖性的IL-1_β和IL-18分泌，并显著减少caspase-1的加工。Ponatinib还减少了小胶质细胞的IL-1_β分泌，表明该细胞类型中可能存在NLRP3炎症小体抑制，但仍需进一步测试。尽管ponatinib此前已被证明可驱动心脏毒性介导的炎症，但这些数据表明，在特定剂量下，体外ponatinib可以是非细胞毒性的，并能有效减弱巨噬细胞和小胶质细胞中的NLRP3炎症小体活化。

**研究背景**

NOD样受体家族pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体是一种多蛋白复合物，在固有免疫信号传导中发挥关键调控作用。NLRP3活化需要启动和激活两个步骤：启动阶段通过模式识别受体（PRRs）触发转录因子核因子κB（NF-κB）上调pro-IL-1_β和pro-IL-18的表达；激活信号则诱导炎症小体组装，经由NLRP3衔接蛋白——含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的CARD结构域招募pro-caspase-1，后者被剪切活化后切割pro-IL-1_β和pro-IL-18为成熟形式并释放至细胞外。此外，NLRP3活化还导致gasdermin-D依赖的细胞焦亡。尽管NLRP3活化是固有免疫的重要组成部分，其过度活化会驱动多种疾病的炎症过程，包括糖尿病、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病等。因此，鉴定新型NLRP3炎症小体抑制剂具有迫切的临床需求。

**研究概述**

为满足上述需求，研究人员购入了875种FDA批准药物组成的化合物库（Cayman Chemical Company），在骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中系统筛选NLRP3抑制剂，鉴定出包括ponatinib在内的五种候选药物。Ponatinib是一种FDA批准的多靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKI），临床用于治疗慢性髓性白血病（CML）和费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph+ ALL）。通过剂量曲线、细胞毒性/活力测定等实验，研究人员确定了ponatinib在BMDMs中的有效体外浓度为1μM，在原代小胶质细胞中为0.5μM，该浓度可显著降低NLRP3炎症小体活化且不诱导细胞毒性。研究证实ponatinib通过抑制NLRP3和caspase-1依赖性途径减少IL-1_β和IL-18分泌，并在小胶质细胞中同样具有抑制IL-1_β分泌的作用。该研究论文发表在《Immunobiology》期刊上。

**关键技术方法**

该研究使用购自The Jackson Laboratory的C57BL/6J野生型、Casp1^?/?（Cat. No. 016621）和Nlrp3^?/?（Cat. No. 021302）小鼠，其中基因敲除小鼠回交至C57BL/6J背景五代。原代小胶质细胞通过磁激活细胞分选（MACS）从雌性野生型C57BL/6J小鼠脑组织分离。主要技术方法包括：剂量曲线实验确定有效药物浓度、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估细胞毒性、MTT实验检测细胞活力、酶联免疫吸附测定（ELISA）定量细胞因子分泌、Caspase-Glo^? 1炎症小体发光实验检测caspase-1活性，以及11-plex多因子检测（Quansys Biosciences）分析多种细胞因子/趋化因子。

**研究结果**

3.1 Ponatinib抑制BMDMs中的NLRP3炎症小体

剂量曲线实验显示，ponatinib在4μM、2μM、1μM和0.5μM浓度下均显著降低BMDMs中LPS+ATP诱导的IL-1_β分泌，而0.25μM浓度无效。LDH细胞毒性检测确认1μM和0.5μM浓度未增加细胞毒性，MTT活力实验显示1μM处理24h时细胞活力显著下降，但6h和1.25h时无显著影响，故选择1μM作为BMDMs后续实验浓度。在野生型（WT）BMDMs中，ponatinib显著抑制IL-1_β和IL-18分泌并降低caspase-1活性；Casp1^?/?和Nlrp3^?/? BMDMs在刺激条件下不分泌IL-1_β和IL-18，证实这两种细胞因子的产生依赖caspase-1和NLRP3。11-plex多因子检测显示，ponatinib显著降低IL-1_α、IL-1_β和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的分泌，但不影响IL-6、IL-10、TNF-_α、MIP-1_α、RANTES、CXCL1、MDC和TARC的分泌。在全炎症实验中，ponatinib虽降低CXCL1、IL-6、RANTES、TNF-_α、MIP-1_α和MCP-1的分泌，但6h时存在细胞活力下降趋势，研究人员判定这些变化不能仅归因于炎症通路抑制，因此认为ponatinib特异性抑制NLRP3活化而非广谱抗炎。

3.2 Ponatinib减少原代小胶质细胞中的IL-1_β分泌

在原代小胶质细胞剂量曲线实验中，1μM、0.5μM、0.25μM、0.13μM和0.06μM浓度的ponatinib均显著降低IL-1_β分泌。细胞毒性检测显示1μM ponatinib诱导细胞毒性，而0.5μM和0.25μM无毒性效应，故选择0.5μM进行后续实验。在LPS和ATP刺激条件下，0.5μM ponatinib显著降低了原代小胶质细胞的IL-1_β分泌。

**讨论与结论**

讨论部分指出，文献中关于ponatinib对炎症的作用存在分歧。Arzuk等研究发现ponatinib通过氧化应激增加NLRP3 mRNA表达和IL-1_β产生，但该研究使用的浓度高达本研究的100倍且处理时间更长；Tousif等发现ponatinib通过增加S100A8/A9警报素产生触发炎症和心脏毒性，但未完全区分全身性炎症与N