主动靶向纳米颗粒的配体-受体相互作用程度随配体密度和受体表达的变化

《ACS Applied Materials & Interfaces》：The Extent of Ligand–Receptor Interactions for Actively Targeted Nanoparticles as a Function of Ligand Density and Receptor Expression

　　

摘要

研究人员评估了以不同比例共价功能化的奥曲肽（Octreotide，Oct）——一种生长抑素受体（SSTRs）的强效激动剂——及一种乱序肽（scrambled peptide）修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒（mesoporous silica nanoparticles，MSNs），在恒定总肽载量和SSTR2条件下，其相互作用随受体表达的变化。奥曲肽表面浓度的增加以及受体表达水平的升高均导致总配体-受体相互作用的增强。在中等奥曲肽表面浓度下，观察到低受体表达细胞与高受体表达细胞之间传感器响应差异所体现的最高选择性水平。然而，颗粒内化动力学随受体水平升高而降低，这使得基于颗粒摄取判断的选择性相较于配体-受体相互作用程度有所下降。研究结果凸显了直接评估配体-受体相互作用并结合颗粒摄取分析对于增强对纳米颗粒在生物系统中行为的机理性理解的重要价值，从而能够实现主动靶向纳米载体的合理设计。

**论文解读：靶向配体密度与受体表达水平对主动靶向纳米颗粒配体-受体相互作用的协同调控**

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## 1. 研究背景与目的

纳米颗粒药物递送系统通过在表面偶联靶向配体，可实现对过表达特定受体的靶细胞的主动靶向，从而提高治疗效率并降低系统毒性。这种主动靶向依赖于配体与细胞表面受体之间的特异性多价相互作用（即亲和力，avidity）。然而，传统的靶向性评估大多基于数小时尺度的细胞摄取实验，难以直接反映配体-受体相互作用的真实强度，且摄取结果往往受到受体密度、受体膜流动性限制以及内吞途径激活等多种动力学因素的影响。

为克服上述瓶颈，本研究在先前基于基因编码cAMP探针的功能性生物传感器基础上，进一步构建了可理性调控生长抑素2型受体（SSTR2）表达水平的TETGlo传感系统，以定量研究不同奥曲肽（Oct）表面浓度和不同受体表达水平下，纳米颗粒配体-受体相互作用的程度，并系统比较其与细胞摄取动力学之间的差异。该研究旨在揭示配体密度与受体表达水平对靶向效率的协同效应，为主动靶向纳米载体的合理设计提供更准确的评价方法。

## 2. 主要技术方法

研究人员采用多学科交叉的实验方法体系，主要包括以下几项关键技术平台：

- **TETGlo双调控传感系统**：将TetON 3G诱导表达系统与GloSensor-22F cAMP生物传感器结合，通过多西环素（DOX）剂量梯度精确定制HEK293细胞SSTR2膜表达水平，并以高斯荧光素酶（GLuc）和HA标签定量受体表达量；
- **介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）表面功能化平台**：通过EDC/NHS偶联化学将不同比例的Oct靶向肽与无靶向活性的乱序肽（SP）共价连接到MSN表面，在恒定总肽载量条件下系统改变配体表面密度；
- **实时活细胞生物发光检测**：基于毛喉素（FSK）诱导cAMP升高、Oct激活SSTR2后降低胞内cAMP水平的原理，实时定量配体-受体激活程度；
- **流式细胞术摄取分析**：结合ATTO488荧光标记和台盼蓝淬灭技术，区分并定量内化与膜结合颗粒；
- **多维度颗粒表征**：TEM、DLS、zeta电位、氮气吸附（BET/NLDFT）、SDS-PAGE蛋白冠组成分析等，确认颗粒理化性质的可比性。

## 3. 研究结果

### 3.1 配体-受体相互作用——传感器细胞表征

研究人员成功构建了TETGlo系统，验证了DOX浓度依赖的SSTR2表达调控能力，膜表面受体水平在DOX ≥ 5 ng mL?1时达到平台期，与组成型过表达细胞水平相当（图2b）。游离Oct呈明显浓度依赖性受体激活，EC??处于低纳摩尔范围，且EC??不随受体表达水平变化，证明受体表达量不影响Oct对SSTR2的固有亲和力（图3）。在1 μM Oct浓度下，传感器响应平台值与受体表面浓度呈线性关系，表明此时所有可用受体均被激活（图3d）。

### 3.2 MSN-Oct颗粒表征

颗粒呈单分散球形，平均直径约170 nm，BET比表面积1088 m2 g?1，外比表面积64 m2 g?1，平均介孔直径3.2 nm。Oct/SP摩尔比在0-100%范围内变化的MSN.X系列颗粒具有几乎相同的zeta电位、分散性和血清蛋白吸附模式（图4b、图S13），排除了理化性质差异对细胞相互作用的干扰。总肽载量约为0.056 μmol mg?1（MSN.0为0.077 μmol mg?1）。基于外表面归一化的肽表面密度约为16个肽/100 nm2，处于文献报道的纳米颗粒配体密度范围内。

### 3.3 MSN-Oct靶向性评估

在150 μg mL?1颗粒浓度下，MSN.0不激活SSTR2，而随Oct比例升高至MSN.70，传感器响应逐级增强并与受体表达水平正相关（图5）。但MSN.70与MSN.100的反应几乎相同，提示过高的配体密度可能导致空间位阻而阻碍有效配体-受体结合。MSN.50和MSN.70在区分高、低受体表达细胞方面表现出最高的选择性。与游离Oct相比，颗粒结合的Oct需要高得多的总Oct浓度才能产生相当的受体激活，即使在最高配体密度下颗粒也仅能激活约1/6的可利用SSTR2（图6）。后续加游离Oct实验证明颗粒占据受体后仍存在大量游离受体，证实传感器信号确实定量反映了纳米颗粒表面的配体-受体相互作用。

### 3.4 颗粒内化——MSN.X在HEK293细胞中的摄取

在0.1% BSA条件下，HEK-SSTR2细胞对MSN.70和MSN.100在1 h即显示明显主动靶向摄取效应，MSN.50在3 h显效；而高受体表达的HEK-SSTR2细胞摄取速率反而低于基础受体表达的HEK TetGlo细胞，表明高受体密度可能因限制受体膜扩散速率而降低内吞动力学（图7）。在9% FCS血清条件下，所有颗粒的摄取明显减慢，1 h未见靶向效应，但3 h后出现Oct浓度依赖的主动摄取增强且持续至6 h；然而MSN.100的摄取始终低于MSN.70，尽管二者具有几乎相同的配体-受体激活水平（图8）。蛋白冠可能在膜运输中起到双重作用，既部分遮蔽靶向肽又促进颗粒-细胞膜相互作用。

## 4. 结论与讨论

本研究通过TETGlo系统定量揭示了配体密度和受体表达水平对主动靶向纳米颗粒配体-受体相互作用的协同调控规律。主要结论如下：

（1）本研究成功开发了可精确控制SSTR2表达水平的TETGlo生物传感系统，实现了对纳米颗粒配体-受体相互作用的实时定量评估。该系统有效排除了非特异性摄取效应的干扰，为主动靶向纳米载体的理性设计提供了可靠的方法学平台。

（2）配体-受体相互作用程度随Oct表面浓度和受体表达水平的升高而增强，但在最高配体密度（MSN.100）出现平台效应，提示过密配体排列可能因空间位阻和受体簇集限制而降低结合效率。选择性分析表明，中等配体密度（MSN.50/70）能够在不同受体表达水平细胞间产生最大的响应差异。

（3）颗粒内化动力学与配体-受体相互作用之间存在非单调关系：高受体表达反而降低了颗粒摄取速率，这归因于受体密度升高导致受体膜侧向扩散受限，从而减缓了内吞过程的动力学。该发现强调，仅以细胞摄取量作为靶向性评价指标可能产生误导性结论。

（4）血清蛋白冠的存在整体降低了摄取动力学但可增强后期配体驱动的特异性摄取，同时维持相近的蛋白冠组成，进一步支持观察到的颗粒-细胞差异源于配体-受体特异性相互作用而非非特异性理化效应。

（5）该研究证明了直接定量配体-受体相互作用结合摄取动力学分析的必要性，为开发更精准、高效的主动靶向纳米药物递送系统奠定了重要的方法学基础。论文发表在《ACS Applied Materials 》。